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背景:病毒性心肌炎(Viral myocarditis)是由病毒引起的心肌疾病,多见于儿童,成人散发。该疾病大多患者预后良好,少数可发展为扩张性心肌病,引发急性心力衰竭、心源性休克甚至猝死。有多种病毒可以引起病毒性心肌炎,其中柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)是导致病毒性心肌炎的主要病毒之一。CVB3属于小RNA病毒科肠道病毒属,基因组为单股正链RNA,只编码一个开放阅读框(open reading frame,ORF)。MicroRNA(miRNA)是真核生物中一类长度约为 18-25个核苷酸组成的非编码小分子单链RNA,通过与靶基因的3’-UTR特异序列完全和或不完全互补结合的形式,使靶基因mRNA降解或抑制翻译,达到反向调控靶基因的作用,miRNA形成复杂的转录后调控网络调节多种细胞进程。目的:本研究拟通过了解CVB3感染过程中差异表达的miR-324-3p的作用机制,探索miR-324-3p及靶基因对CVB3复制的调控作用及机制,希望能为CVB3感染的诊断和治疗提供理论依据和分子靶点。方法:1.大肠杆菌原核表达系统表达CVB3的3C蛋白并进行兔多克隆抗体制备。2.以未感染细胞作为对照,RT-qPCR分析CVB3感染HeLa细胞5h和8h时miR-324-3p的表达情况。3.HeLa细胞中过表达或沉默miR-324-3p后,通过RT-q-PCR检测未感染、感染CVB3后5h和8h时分析CVB3基因组的复制,Western blot分析病毒蛋白的表达。收集病毒液进行病毒噬斑实验,分析对CVB3的增殖的影响。4.通过miRTarBase和TargetScan数据库筛选miR-324-3p靶基因,荧光素酶报告载体进行验证。5.以未感染细胞作为对照,RT-qPCR和Western blot分析CVB3感染HeLa细胞后3h、4h、5h、6h、8h时trim27的表达变化;HeLa细胞中过表达或沉默trim27,Western blot检测CVB3未感染、感染5h和8h细胞总蛋白,了解trim27对CVB3复制的调控作用;同时收集病毒液进行病毒噬斑实验,分析trim27对CVB3的增殖的调控作用。6.HeLa内过表达/沉默miR-324-3p或trim27,感染CVB3后收集5h和8h总蛋白,以mock作为对照,Western blot分析炎症相关通路细胞因子NF-κB、p-NF-κB和IKKα/β的表达情况。结果:1.在大肠杆菌中成功表达3C蛋白,并免疫新西兰大白兔制备了兔多克隆抗体。2.CVB3感染后HeLa细胞后,Western blot在感染4h可检出VP1蛋白,5h可检出3C蛋白。3.细胞过表达miR-324-3p后,感染CVB3后5h和8h时均可以减少VP1和3C的表达;miR-324-3p被敲减时,感染CVB3后5h和8h时VP1和3C的表达均增加。病毒噬斑实验结果显示,miR-324-3p过表达可减少病毒噬斑产生,敲减miR-324-3p后,病毒噬斑数产生增多。4.MiRNA靶基因预测数据库均发现miR-324-3p靶向trim27的3’UTR,双荧光素酶实验发现,靶向组与对照组相比荧光素表达降低,突变组荧光素表达与对照组比未见明显降低,结果表示miR-324-3p对tr对m27存在靶向调控作用。5.HeLa细胞内过表达trim27后感染CVB3,感染后5h和8h时VP1和3C蛋白表达升高,病毒噬斑产生较多;敲减trim27后,感染CVB3的5h和8h时VP1和3C表达均降低,病毒噬斑产生的数量较少。6.细胞内过表达miR-324-3p能降低IKKα/β和p-NF-KB表达,敲减miR-324-3p时,IKKα/β和p-NF-κB表达量均较对照度高;trim27被敲减时p-NF-KB、NF-κB和IKKα/β表达量较NC组低;过表达trim27后感染病毒,IKKα/β、NF-κB和p-NF-κB表达量均较对照度高。结论:miR-324-3p通过靶向trim27负调控CVB3的复制和增殖。