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D氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase,DAAO)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)为辅酶,催化D型氨基酸的氧化脱氨反应,生成相应的丙酮、氨和过氧化氢的过氧化物酶。因为其广泛的底物特异性,真核生物的DAAOs广泛用于工业、医药、生物合成和分析等行业。表达活性包涵体(Inclusion bodies,IBs)是生产一种特殊的无载体固定化蛋白方法,具有产量高、稳定性好、易纯化等优点。在本实验中,我们构建不同人DAAO(hDAAO)基因,在大肠杆菌不同菌株中重组表达,比较不同构建体的不溶性DAAO蛋白的产量和活性,获得以下结果:1.构建hDAAO蛋白:克隆和合成编码hDAAO和密码子突变体基因,选取了四种融合标签,包括纤维素结合结构域、硫氧还蛋白、谷胱甘肽硫转移酶和大肠杆菌起始因子IF2上游7个氨基酸组成的寡肽,融合野生型hDAAO,在标签和靶蛋白之间插入烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease,TEVp)识别序列tevS(即ENLYFQG)。2.重组蛋白的表达和活性分析:将构建的表达载体分别在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中诱导表达,分析不同融合标签、rRNA丰度、tevS序列及密码子偏好性对其产量和活性的影响。结果表明,所有加入的标签或序列都影响hDAAO的产量和活性。其中密码子突变结合表达稀有密码子对提高hDAAO的产量和活性优于融合蛋白。3.底物特异性检测:hDAAO活性突变体催化三种D型氨基酸(D-丙氨酸、D-丝氨酸和D-天冬氨酸)的活性差异显示,不溶性聚集对底物专一性改变没有明显影响。4.偶联活性测定法分析玉米丝氨酸消旋酶的活性:将纯化的hDAAO密码子突变体蛋白和纯化的重组玉米丝氨酸消旋酶(Zea may serine racemase,ZmSR)混合,以L-丝氨酸为底物,测定hDAAO催化产物,结果显示,纯化的hDAAO活性包涵体比商业化分离的猪源DAAO效率高。综上所述,我们发现一种新型有效的利用N端密码子优化和共表达稀有tRNA生产hDAAO活性包涵体的方法,它有望用于将大肠杆菌表达折叠效率较低的蛋白或酶转变成活性包涵体。