龋病(dental caries),俗称虫牙或蛀牙。它是牙体硬组织发生的慢性、进行性破坏的疾病。其具有发病率高、分布广等特点,目前已严重影响到了人们的生活质量。因此,需要寻找一种能有效降低患龋率的方法已成为当今研究的热点。变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是人类最主要的致龋菌,其中主要的致龋毒力因子是表面蛋白(surface protein antigen,PAc)和葡糖基转移酶(glucosyltransferases,GTFs),研究表明针对这两种致龋毒力因子的抗体,可以有效抑制龋病的发生和发展。因此,“免疫防龋”可成为当今有效控制龋病的方法。本课题组针对这两种毒力因子,成功构建了植物表达载体p CAMBIA-E8-APB-DOCK8(简称p E8AD3),并转化番茄获得转基因番茄植株。转基因植物的食用安全和生态安全受到了人们的广泛关注,目前转基因植物的首要安全问题来源于标记基因的存留,将标记基因去除可消除人们对安全性的顾虑。本实验作为课题组实验的延续,将融合基因表达质粒p E8AD3中的标记基因Km和GUS去除,并进一步探索番茄瞬时转化表达系统,为后续蛋白水平的研究提供实验基础。目的:以课题组构建的质粒pE8AD3为基础,将选择标记基因Km和GUS去除,为后期番茄再生转化提供实验基础,提高转基因植物的安全性。利用农杆菌介导的注射法,建立番茄子叶瞬时表达系统,分析外源基因的表达情况。方法:1、运用DNA重组技术,将p E8AD3中的选择性标记基因Km和GUS去除。2、通过对番茄无菌苗的培育,观察不同番茄品种的出芽数、成苗数及农艺学性状的差异显著性,筛选出适用于本实验的番茄品种;将重组质粒p E8AD3转化农杆菌EHA105,通过对番茄子叶、注射农杆菌浓度、农杆菌注射量、生长苗龄以及共培养天数进行筛选,建立农杆菌介导的番茄子叶瞬时表达系统,观察DOCK8基因的表达情况。3、番茄再生转化中,通过对番茄子叶外植体的培育,侵染农杆菌后的抑菌实验,观察羧苄青霉素、头孢霉素、特美汀3种抗生素在不同抑菌浓度下的抑菌效果及外植体形态的变化,确立抑菌抗生素及浓度;运用PCR检测方法,对课题组获得的转基因番茄果实进行初步筛选。结果:1、成功获得不含标记基因Km和GUS的重组质粒p E8AD3。2、建立番茄子叶瞬时表达系统,适合本实验的番茄品种为欧洲大红(苹果型),选材部位为番茄的子叶,注射农杆菌浓度为OD600为0.2-0.7,农杆菌注射量为50μL,苗龄为7-10 d,共培养24-48 h。3、番茄再生转化中,特美汀作为一种有效抑制农杆菌的抗生素,抑菌效果显著,对植物影响小,特别适用于较难转化的材料的转基因过程,抑菌浓度为400 mg/L为宜,抑菌浓度过大或过小均会影响外植体的生长;PCR筛选出阳性番茄果实并保种。结论:1、获得了可用于植物遗传转化的不含Km和GUS选择标记基因的融合基因表达载体p E8AD3,该载体含有果实特异性启动子E8,APB中包含cat、Pac A和ctx B基因,以及胞质分裂专一蛋白8(DOCK8)。2、建立并优化农杆菌介导的番茄子叶瞬时表达系统,该系统的优点是操作简单,不需要昂贵的试剂和仪器,在短时间内可分离蛋白,为进一步探索目的蛋白的生物学功能提供实验基础,为后期外源基因蛋白表达分析的研究提供一种方便、快捷和有效的方法。3、优化出浓度为400 mg/L的特美汀抗生素作为番茄(欧洲大红)转基因选择压,该抗生素与其他抗生素相比,其优点是能有效抑制农杆菌的生长,对植物影响小,特别适用于较难转化的材料的转基因过程,尤其是农杆菌OD值较高,很难被其他抗生素抑制时效果较为理想。4、获得含GUS报告基因的转基因(p E8AD3)阳性番茄果实,并成功用于种子的保存和繁育。