研究背景谷氨酸兴奋性中毒是多种神经退行性疾病如青光眼、糖尿病性视网膜病变等的致病机制之一。尽管谷氨酸是神经系统常见的神经兴奋性递质,但是一旦谷氨酸的含量过多,过量的谷氨酸聚集在细胞外,大量激活NMDA受体,引起离子通道的开放,钙离子大量内流,线粒体肿胀,细胞功能紊乱,产生各种凋亡信号分子,引起细胞凋亡。RGC上有NMDA受体,对谷氨酸敏感,因而过量的谷氨酸会造成RGC的凋亡。而RGC是唯一能将视觉信号从视网膜传递到中枢神经系统的神经细胞,它的损伤及凋亡是一种不可逆转和不可再生的过程,对视功能的影响尤为严重。谷氨酸兴奋性毒性对RGC的损伤是青光眼、糖尿病性视网膜病变等多种神经退行性眼病的共同阶段,不过它对RGC的损伤机制至今没有完全阐明,如何保护RGC免受其害也在不断探索及研究中。晚期糖基化终末产物受体（the receptor for advanced glycation endproducts,RAGE）是一种多配体受体,它与多种不同的配体结合后参与多种眼部疾病的发生及发展。它主要分布在视网膜的神经细胞,血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium,RPE）,在病理条件下时也会在视网膜前膜或新生血管膜上表达。不同的配体在不同的病理环境下介导细胞功能紊乱,比如高血糖时晚期糖基化终产物（advanced glycation endproduct,AGE）聚集后与RAGE作用后参与炎症反应,神经元退变和视网膜微血管的功能紊乱的发生。在年龄相关性黄斑变性时,AGE和RAGE也会在RPE、玻璃膜疣、Bruch膜中明显增多,并在外层视网膜中参与慢性炎症反应。研究RAGE在视网膜退行性疾病中作用及作用机制,为临床相关的治疗方法提供可能性,是非常值得我们去探索研究。研究目的探究不同剂量N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）在小鼠玻璃体腔注射后,不同时间点时对RGC损伤的过程并筛选出最适剂量及作用时间。建立小鼠RGC缺失模型,探索RAGE在视网膜上的分布及表达,筛选RAGE调控的相关信号通路后,研究该信号通路的表达及作用机制。研究方法7周龄的C57BL/6J小鼠,性别不限,行双眼玻璃体腔注射术,一眼为空白对照组注射10×PBS,另一眼为NMDA损伤组,注射10nmol、20nmol、30nmol的NMDA,在第12h、1天、3天、5天、7天行HE染色观察视网膜形态学变化,全视网膜铺片计数RGC的细胞密度以及TUNEL法检测RGC的凋亡比率。确定NMDA造模的作用剂量及时间后,冰冻切片荧光染色观察RAGE的表达位置,蛋白印迹法（Western Blotting,WB）检测RAGE在空白对照组及NMDA损伤组的蛋白表达量。筛选RAGE介导的信号通路,WB检测JAK1、JAK2、STAT1、STAT3总蛋白及磷酸化蛋白的表达量。不同剂量的RAGE抑制剂——FSP-ZM1（25pmol,50pmol,75pmol,100pmol溶于DMSO溶液,用10×PBS配制）和NMDA同时玻璃体腔注射后观察并检测RAGE的表达量,选择合适的FSP-ZM1干预剂量即FSP-ZM1组。为了探究RAGE如何调控JAK/STAT信号通路,通过HE染色组织切片测量观察空白对照组、NMDA损伤组、FSP-ZM1组及DMSO组视网膜全层厚度、GCL厚度及INL厚度,WB检测各组磷酸化蛋白pJAK1、pJAK2、pSTAT1、pSTAT3的表达情况以及全视网膜铺片计数各组RGC的细胞密度。为进一步研究JAK/STAT在NMDA-RGC模型中的作用,玻璃体腔同时注射不同剂量JAK2/STAT3的抑制剂WP1066和NMDA后,通过HE染色组织切片测量空白对照组、NMDA损伤组、各剂量WP1066组及DMSO组视网膜全层厚度、GCL厚度及INL厚度,WB检测各组磷酸化蛋白pJAK2、pSTAT3、抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax的表达情况,以及全视网膜铺片计数各组RGC的细胞密度。同样的,在给予不同剂量JAK1抑制剂Ruxolitinib或STAT1的抑制剂2-NP和NMDA后,测量空白对照组、NMDA损伤组、各剂量Ruxolitinib或2-NP组及DMSO组视网膜全层厚度、GCL厚度及INL厚度,WB检测各组磷酸化蛋白pJAK1、pSTAT1、Bcl-2和Bax的表达情况以及全视网膜铺片计数各组RGC的细胞密度。研究结果1.NMDA小鼠玻璃体腔注射后,全层视网膜厚度变薄,主要集中在GCL和INL,全视网膜铺片可见RGC数量减少,分布不均,血管走行模糊不清,凋亡检测可见TUNEL染色阳性RGC。同一作用时间下,随着NMDA的剂量从10nmol增加到20nmol再到30nmol,全层视网膜厚度渐渐变薄,GCL尤其明显,RGC的细胞密度随之逐渐减少。NMDA玻璃体腔注射12h已经对RGC造成损伤,1天时损伤程度明显加重,到3天时存活RGC数量非常少,到第5天和第7天时RGC数量已所剩无几。2.RAGE在NMDA损伤组蛋白表达量比空白对照组增多,主要分布在Müller细胞上,同时伴有Müller细胞标志物GFAP的增多。JAK1、JAK2、STAT1、STAT3总蛋白在空白对照组和NMDA损伤组之间的表达量无统计学意义,但pJAK1、pJAK2、pSTAT1、pSTAT3在空白对照组和NMDA损伤组之间有统计学意义。用FSP-ZM1抑制RAGE的表达量后,pJAK1、pJAK2、pSTAT1、pSTAT3的蛋白表达量也随之减少。全层视网膜厚度和GCL厚度在FSP-ZM1组有所增加。FSP-ZM1组RGC的细胞密度明显多于NMDA损伤组。3.不同抑制剂降低pJAK1、pJAK2、pSTAT1、pSTAT3的蛋白表达量时,Bcl-2的表达量增加,而Bax表达量降低,此时视网膜厚度及GCL厚度发生改变,比NMDA损伤组的厚度增厚,全视网膜铺片可见RGC的细胞密度有所增加。研究结论1.20nmol NMDA玻璃体腔注射1天后,快速有效地诱导RGC缺失,是NMDA造模的合适剂量及作用时间。2.RAGE通过上调JAK1、JAK2、STAT1、STAT3的表达量参与NMDA损伤RGC细胞过程,抑制RAGE的蛋白表达量后,GCL厚度增加,存活的RGC数量增加,对RGC起到保护作用。3.抑制JAK1、JAK2、STAT1、STAT3表达量,增加GCL厚度及RGC存活数量,对RGC有保护作用。