研究背景 中脑是脑干的重要组成部分之一，结构复杂，内有许多核团和纤维束。中脑损伤是脑干损伤中的一种特殊类型，大约50％～70％的脑干损伤合并有不同程度的中脑损伤。脑干损伤(primary brain stem injury)是一种致命性损伤，死亡率超过44.1％～62.5％，存活者重残率高达60％以上，其中植物生存者超过1／3。如何使包括创伤性脑干损伤、脑中风等疾病引起的持续性植物状态(PVS)以及创伤性脊髓损伤所致截瘫等在内的一系列中枢神经系统疾病得到妥善治疗，使其造成的后果和并发症减少到最低程度，一直是神经内外科医生和神经科学工作者奋斗的目标。 近年来的研究成果表明，神经系统损伤具有修复的潜能，因为发现了成体神经组织内仍然存在有可分裂增殖的神经干细胞。因此，对内源性神经干细胞进行人工干预调控，促使其继续增殖和分化；或进行神经干细胞移植，以促进中枢神经系统损伤的修复等，是目前治疗神经系统损伤及退行性疾病的最新和最有希望的方法。骨髓基质细胞多潜能性的发现和向神经细胞方向定向分化的成功，为神经干细胞的来源增加了一个新的途径，也为解决“自体源神经干细胞”移植方案中细胞数量不足的问题提供了很好的思路。 通过建立体外、体内实验模型等手段，对骨髓基质细胞的体外扩增、定向分化方案，及移植细胞在脑内的存活、迁移、整合情况等方面进行研究探索，有利于自体干细胞移植技术的规范化开展和推广应用。 第一部分 目的 1．建立骨髓基质细胞快速扩增方案，为骨髓基质细胞作为“种子细胞”在医学和组织工程学领域的广泛应用创造条件。 第一军医大学博士研究生学位论文 2．建立骨髓基质细胞向神经干细胞定向分化的体外模型，探索骨髓 基质细胞向神经干细胞定向分化的可行性，为“骨髓源神经干细胞”的 临床应用提供理论依据。 方法 1．无菌穿刺抽取骨髓，密度梯度离心，粘附法提取骨髓基质细胞。 然后在 D－MEM” 培养基（lml／孔）内加 bFGF（10ng／inlX EGF （ ong／ml），进行扩增培养。待 ZWk左右，细胞接合后，胰蛋白酶消化。 收集细胞；配成 10‘个活细胞／ml的浓度（工作浓度）备用，或进行 50 倍稀释后继续扩增培养。 2．将工作浓度细胞接种于 96孔板，分别将 bFGF、EGF按不同终 浓度（单独或联合）加人培养板内。孵育6h后2％戊二醛固定，记数、 比较不同浓度bFGF、EGF对BMSCs粘附特性的影响。 3．用 a．MTT法和 b．细胞集落记数法检测分析不同终浓度（单独或 联合）bFGF、EGF分别在实验第 IX 24小时、3 X 24小时、5 X 24小时、 7x犯小时4个时间点对＊＊肌s的存活和增殖能力的影响。 4．SABC法鉴定不同浓度RA、BDNF、GDNF（单独或联合）情况 下，第 IX 24小时、3 X 24小时、7 X 24小时三个时间点细胞分化情况。 一抗分别为：鼠抗－巢蛋白（Nestin）、兔抗－神经元特异稀醇化酶（NSE）。 鼠抗－胶质纤维酸性蛋白（GFAP人 二抗为羊抗兔／或鼠 IgG。DAB显色。 结果： 1．骨髓细胞原代培养6h内有成纤维细胞样细胞贴壁生长，48h去 除非粘附细胞后，粘附细胞有大、中、小三种形态；加入bFGF、EGF 扩增培养24h后见细胞分裂相；培养72h有克隆形成：至2＿k时，大型 的成纤维样细胞铺爬满培养板底部。 二．传代后观察可见细胞均匀散在分布，约 10－14d后细胞接合，大 部分细胞的形态属成纤维样（同前），仍有小型和中型细胞。 3．bFGF、EGF对BMSCS粘附特性均有促进作用；bFGF对BMSCS 的粘附促进作用优于EGF。二者联合应用优于单独使用。 4．bFGF、EGF对BMSCS存活及增殖均有促进作用；bFGF的促进 存活作用优于EGF。EGF的促进增殖作用优于bFGF。二者联合应用优 于单独使用。 3 第一军医大学博士研究生学位论文 5．RA、BDNF、GDNF均可促进BMSCS向神经干细胞方向分化。三者连合应用优于单独使用。RA、BDNF、GDNF不但可以促进BMSCS向神经干细胞方向分化，而且可以促进神经干细胞向成熟神经细胞方向分化。加入 RA、BDNF及 GDNF进行诱导分化培养第 10d时即可见到有神经细胞（神经元、胶质细胞）样细胞形成。 结论 1．骨髓基质细胞形态多样，至少有H种形态。不但在适当条件下可以快速扩增，而且在适当条件下可以向神经细胞方向分化。 2．bFGF、EGF对BMSCS的粘附、存活和增殖均有促进作用。bFGF