芸薹生链格孢Abcdm1基因的克隆及功能初步分析

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芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola(Schw.)Wiltshire)侵染导致的黑斑病是十字花科蔬菜生产上的重要病害之一,在蔬菜的田间生长期和储藏期均可危害,严重影响到该类蔬菜的产量、品质和安全性。但是对于其防控至今还未找到非常有效的措施。分生孢子在真菌的致病过程中起着重要的作用,因此查找芸薹生链格孢的产孢相关基因并对产孢机制进行研究,将有助于深入认识其致病机制,从而为病害的防治提供新的策略。本研究对前期构建的芸薹生链格孢转化子库进行了筛选,共得到了19株产孢缺陷突变体,利用Hitail-PCR技术对产孢缺陷突变体的插入位点侧翼序列进行克隆,得到了突变体M85的右翼序列,序列分析显示该右翼序列为酵母转录因子Ndt-80同源基因,命名为Abcdm1(A.brassicicola conidiation-deficiency mutant)。对Abcdm1基因进行了克隆和序列分析,同时根据同源重组原理,采用PEG介导的原生质体转化的方法,获得1个基因敲除突变体ΔAbcdm1和1个回复突变体C,并进行了生物学功能分析,研究结果如下:对芸薹生链格孢转化子库进行了产孢缺陷突变体的筛选,共得到了19株产孢降低的突变体,其中产孢能力完全丧失的有13株,分别M17,M37,M51,M56,M73,M85,M131,M96,M101,M133,M159,M204,M324;产孢能力显著降低的有6株,为M15,M108,M122,M183,M258,M177。Hitail-PCR得到了M85突变体的右翼序列,为酵母转录因子Ndt-80同源基因,命名为Abcdm1。对Abcdm1基因进行了扩增和分析,该基因全长1905 bp,cDNA 1632 bp,编码543个氨基酸,并发现该基因与其它真菌同源性较低。Abcdm1基因参与芸薹生链格孢的菌丝生长调控,突变体ΔAbcdm1气生菌丝变长,呈绒毛状,菌丝纯白,无黑色素,但是突变体菌落生长速度与野生型菌株一致。Abcdm1基因参与调控芸薹生链格孢的产孢,突变体ΔAbcdm1产孢能力完全丧失。Abcdm1基因参与芸薹生链格孢的胁迫调控,突变体ΔAbcdm1对KCl和NaCl敏感性升高,对氧胁迫因子H2O2敏感性较低。Abcdm1基因参与体外穿透力的调控,突变体ΔAbcdm1体外穿透能力完全消失,但是致病性与野生型相比无差异。Abcdm1基因参与营养代谢的调控。突变体ΔAbcdm1对碳源和氮源的营养应答的反应不同。在基础培养基上MM上加入葡萄糖之后,我们发现突变体几乎不生长。然而在基础培养基上加入BSA之后,突变体可以进行生长。综上所述,在芸薹生链格孢(A.brassicicola)中Abcdm1基因参与胁迫敏感性的应答、营养代谢的应答和体外穿透力。
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