论文部分内容阅读
产后抑郁(PPD, postpartum depression)是发生于产褥期的一种常见精神疾患。由于母子之间的特殊联系,患有PPD的母亲对其子女的生理及心理发展会产生不良影响。PPD母亲的子女更易行为异常,有更多自杀观念,并且抑郁症首发年龄更早。母亲患产后抑郁,可作为婴儿出生后,早期遭遇到的不良应激,可能会导致婴儿患抑郁症的易感性大幅提高。由于母代产后抑郁症而增加了子代罹患抑郁症的危险性,给家庭和社会带来沉重负担,因而,如何防治母代抑郁影响子代抑郁发病已成为当今社会亟待研究的热点问题。依据本病的临床发病特点,本实验研究认为子代抑郁症属于中医的“郁病”范畴之内,病机为“虚瘀(郁)并见”,治法上宜理气解郁,益气养阴。越鞠丸是中医理气解郁的经典方药,而甘麦大枣汤是益气养阴的名方。本实验研究越鞠甘麦大枣汤合用来治疗子代抑郁症的疗效,并且对其中的作用机制进行分析和探讨。目的：观察产后抑郁对于子代小鼠抑郁样行为的影响,探讨其影响机制,并观察越鞠甘麦大枣汤的快速干预作用,为越鞠甘麦大枣汤治疗子代抑郁症提供理论和实验支持,从而进一步探索中医药在防治子代抑郁症方面的手段和方法。方法：Balb/c雌鼠给予慢性应激3周：束缚(6小时／天)联合24小时光照刺激(2次／周)后造成抑郁模型,后令其休息3周,待抑郁样表型消退后再与Balb/c雄鼠交配繁育F1代。产后3周再次测量行为学验证母代抑郁样表型,从而建立起产后抑郁子代(F1)模型。成年F1代雄鼠与正常雌鼠交配,繁育出F2代。实验包括六个部分：1.产后抑郁对F1代小鼠青少年期及成年期抑郁样行为的影响。通过测量F1代小鼠体重、糖水偏好、强迫游泳及新奇环境摄食实验等抑郁样行为的差异,探讨产后抑郁对F1代小鼠青少年期及成年期的影响。2.产后抑郁对F1代小鼠青少年期及成年期AKT-mTOR信号通路的影响。运用western blot方法测量F1代小鼠海马中AKT、mTOR、p70S6K、4EBP-1、DISCI磷酸化及总体水平的表达,观察产后抑郁对于子代小鼠青少年期及成年期AKT-mTOR通路的影响。3.产后抑郁对F2代小鼠抑郁样行为及AKT-mTOR信号通路的影响。通过行为测试和western blot方法观察产后抑郁第二代小鼠的抑郁样行为和海马中AKT、mTOR、p70S6K磷酸化及总体水平的表达分子表达的变化。4.对产后抑郁F1代小鼠海马甲基化致病基因的筛选研究。对富集的CpG位点运用RRBS测序法进行测序,研究子代抑郁症密切相关的基因甲基化水平的改变,并且用KEGG pathway分析和GO分析探究与子代抑郁发病相关的基因功能网络。5.越鞠甘麦大枣汤对产后抑郁F1代抑郁样行为的快速干预作用。将子代小鼠分为：产后抑郁子代给予生理盐水组(Veh),产后抑郁子代给予越鞠甘麦大枣汤组(YG)以及产后抑郁子代给予氯胺酮组(Ket)。Veh组给予生理盐水,YG组给予越鞠甘麦大枣汤,Ket组给予氯胺酮。再观察行为学以确认越鞠甘麦大枣汤子子代抑郁的干预作用。6.越鞠甘麦大枣汤对产后抑郁F1代小鼠成年期AKT-mTOR信号通路的干预作用。运用western blot方法测量子代小鼠海马中AKT、mTOR、p70S6K、DISC1磷酸化及总体水平的表达,观察产后抑郁对于子代小鼠mTOR通路的影响。结果：1.产后抑郁F1代小鼠在出生后第3周及第4周体重显著低于正常对照组(第3周：p<0.001；第4周：p<0.01),糖水偏好较正常对照组显著下降(p<0.001),强迫游泳不动时间显著增加(p<0.01),新奇环境摄食实验中摄食潜伏期显著延长(p<0.001),摄食量显著减少(p<0.01)。产后抑郁F1代小鼠在成年期糖水偏好上显著低于正常对照组(p<0.001)；单位体重摄食量显著降低(p<0.001)；悬尾不动时间显著延长(p<0.001)；强迫游泳实验的不动时间显著延长(p<0.001)。2.青少年期产后抑郁F1代小鼠海马中m-TOR分子的磷酸化显著下降(p<0.05),总mTOR分子表达并未改变,磷酸化的mTOR分子(p-mTOR)与总mTOR的比值显著下调(p<0.05)；AKT分子的磷酸化水平显著低于正常对照组(p<0.01),而总AKT表达水平无显著差异(p>0.05),并且磷酸化的AKT(p-AKT)与总AKT表达水平的比值也无显著变化(p>0.05)；S6K的磷酸化水平(p-p70S6K)显著下降(p<0.05),而4EBP-1的磷酸化水平并无显著变化(p>0.05); DISCI显著上调(p<0.05)。成年期产后抑郁F1代小鼠海马中AKT分子的磷酸化水平仍显著降低,p-AKT与总AKT表达水平的比值也显著降低。m-TOR分子的磷酸化显著下降,p-mTOR与总mTOR的比值显著下调。S6K的磷酸化水平也显著下降,而DISCI无显著变化。3.产后抑郁F2代小鼠在新奇环境摄食实验上表现出潜伏期延长的趋势,摄食量的显著下降(p<0.05),糖水消耗量也显著下降(p<0.05)。在分子水平上,产后抑郁F2代小鼠海马中AKT的磷酸化水平显著降低(p<0.01),m-TOR的磷酸化显著下降(p<0.05),总mTOR表达显著下降(p<0.05),并且S6K的磷酸化水平(p-p70S6K)也显著下降(p<0.01)。4.抑郁症密切相关的基因的甲基化水平发生异常变化,如Adcyap1、Mapk家族相关基因,Pik3c、Grinl (NMDAR1)、Grin2d (NMDAR2d)、Grml (GluRl)以及钙调蛋白家族基因(Camk2b、Camk2g、Camk2nl)等。同时发现了与抑郁症密切相关的通路上的甲基化异常区域有显著差异,如MAPK信号通路,mTOR信号通路以及Wnt信号通路等。MAPK信号通路中DMRs基因数目有267,mTOR信号通路中有53个,Wnt信号通路中有152个。5.越鞠甘麦大枣汤可使产后抑郁F1代小鼠糖水偏好显著上升(p<0.001)；增加摄食量(p<0.001)；缩短悬尾和游泳测试的不动时间(p<0.001)。6.越鞠甘麦大枣汤快速上调产后抑郁F1代小鼠海马p-AKT、p-mTOR和p70S6K表达(p<0.05),但DISCI的表达未受到越鞠甘麦大枣汤影响。结论：1.产后抑郁F1代早在青少年期已表现出抑郁样行为,并且这一行为可持续到成年期。2.产后抑郁F1代小鼠在青少年期及成年期AKT-mTOR信号通路上相关分子均显著下调,提示其可能是产后抑郁F1代抑郁样行为的部分内在机制。3.产后抑郁母代对于子代的不良影响可持续到F2代。F2代在成年期表现出显著的抑郁样行为,并且伴随着海马AKT-mTOR通路的显著下调。4.产后抑郁F1代小鼠海马中与抑郁症密切相关的一些基因和信号通路发生了异常甲基化情况,这些甲基化水平的升高或降低可能会导致基因表达异常,可能成为子代小鼠抑郁样表型的部分内在机制。5.越鞠甘麦大枣汤可快速缓解产后抑郁F1代的抑郁样行为。6.越鞠甘麦大枣汤可快速可上调产后抑郁F1代海马中AKT-mTOR通路分子的表达,可能进一步促进突触可塑性的改变,从而发挥了快速的抗抑郁作用。