硝化作用是海洋氮循环的一个重要组成部分,在营养缺乏且有氧的南海水体环境中,硝化作用可能是最主要的氮循环过程。海洋水体环境已知的硝化菌包括氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)、氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)和亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite-oxidizing bacteria,NOB),都是无机化能自养微生物,主导硝化作用,分别将NH3氧化为NO2-,进而氧化为NO3-,获得能量并固碳合成有机物,是海洋氮循环和碳循环相互耦合的典型代表。硝化作用的第二步—亚硝酸盐氧化主要由NOB主导进行,NOB在一定程度上决定了南海氮元素的流动方向和效率(NO2-→NO3-),而且作为自养生物,NOB的固碳作用可能也是南海初级生产力和储碳过程的重要组成部分,NOB对海洋氮循环和碳循环可能都起到至关重要的作用。到目前为止,对海洋NOB的研究主要集中在亚硝酸盐氧化速率的研究上,而NOB在海洋环境中的丰度、多样性、群落结构、空间分布及受控环境因子等生态学方面的研究较少,况且已开展研究的区域大多在氧最小带(Oxygen minimum zones,OMZ)等特殊环境,对更普遍的有氧海区的研究较少,NOB在海洋环境下的生存状态、空间分布和影响因素等科学问题尚不清楚,对海洋NOB的了解仍不够全面也不系统,因此有必要对海洋NOB的活性、丰度、群落结构、空间分布及受控的环境因子进行更系统的研究。本文主要以南海北部水体为研究对象,通过稳定同位素15N示踪法测定研究海域的硝化速率;以NOB的两个关键功能基因nxrB(编码亚硝酸盐氧化还原酶β亚基)和aclA(编码ATP柠檬酸裂解酶α亚基)作为分子标记,设计引物并构建了功能基因的DNA文库(基因文库)和RNA的cDNA文库(基因转录子文库)。对多个NOB类群及总细菌和古菌进行定量。采集并测定了多种环境因子。通过α多样性分析、系统进化分析、主坐标分析(Principal Coordinates Analysis,PCoA)和刀切法聚类分析(Jackknife Clustering)、典型相关分析(Canonical Correspondence Analysis,CCA)、Pearson相关分析等多种统计方法分析了南海北部海水中NOB的活性、多样性、群落结构、基因丰度、空间分布,以及硝化速率、基因丰度、环境因子之间的相关性和群落结构与环境因子的相关性。通过稳定同位素15N示踪法分别对南海北部海水进行氨氧化和亚硝酸盐氧化速率测定,结果显示硝化速率在空间分布上存在差异,从垂直分布上看,表层海水的硝化细菌可能受到光抑制或来自浮游植物的底物竞争压力,几乎测不到活性(即亚硝酸盐氧化速率),深海站位次表层和浅海站位底层的氨氧化速率和亚硝酸盐氧化速率最大,200m以下硝化速率逐渐降低;从水平分布上看,外海站位的硝化速率高于近海站位。亚硝酸盐氧化速率普遍高于氨氧化速率,且Pearson相关分析显示氨氧化速率与亚硝酸盐氧化速率没有显著相关性,说明二者不完全耦合,推测除氨氧化为亚硝酸盐氧化提供底物以外,海水中有机聚合体(aggregates)和底层沉积物内部的N03-还原过程也可能为亚硝酸盐氧化提供NO2-。为了检测海洋中NOB主要类群的种类组成、群落结构及丰度,本研究设计了四对具有高度特异性的PCR引物,用以进行NOB氮(nxrB)和碳(aclA)代谢关键功能基因及其转录子序列的克隆文库构建和分析,硝化刺菌科(Nitrospinaceae)和硝化螺旋菌属(Nitrospira)两个NOB类群的关键功能基因nxrB和aclA的DNA和cDNA克隆文库结果显示:NitrospiraaclA在所有采样点都未检测到cDNA序列,无法构建cDNA文库,其它功能基因均能构建DNA和cDNA文库;表层几乎无PCR扩增产物,与该环境中检测到的极低的亚硝酸盐氧化速率一致,表层以下的层位都能构建DNA和cDNA文库。Nitrospinaceae在南海北部海水NOB群落的比例远高于Nitrospira,占98%左右。南海NOB的aclA基因序列间的差异大于nxrB基因序列差异,说明海洋NOB的nxrB基因序列更保守,这更有利于以亚硝酸盐氧化为主要能量来源的NOB的生存。南海北部海水中的Nitrospira序列都属于Nitrospira lineage Ⅵ,而Nitrospinaceae序列与南太平洋东部热带氧最小带海水环境的Nitrospina nxrB基因或源自海洋环境的几个Nitrospinaceae菌的亲缘关系最近,由于序列间相似性较高、差异小,因此分支不明显。Nitrospinaceaae和Nitrospira均存在明显的优势种,且优势种的功能基因都有RNA表达活性,广泛分布于南海北部的海水中。为查明南海北部海水中可能存在的NOB类群及其活性部分的丰度,通过定量PCR(qPCR)方法对环境中不同类群的NOB(包括Nitrospinaceae、Nitrospira、Nitrobacter、Nitrotoga、Nitrococcus)进行了基因及其转录子的定量检测,结果不管是DNA还是cDNA样品,仅检测到Nitrospinaceae和Nitrospira这两个类群,且Nitrospinaceae丰度占绝对优势,因此Nitrospinaceae是南海北部海水中亚硝酸盐氧化过程的主要参与者和贡献者。Nitrospinaceae最多能占到原核微生物总群落的3.9%左右。两个NOB类群的nxrB与aclA的基因丰度的空间分布特征一致,且nxrB与aclA基因转录子丰度的空间分布特征也一致,表层几乎检测不到基因丰度,而深海站位真光层底部和浅海站位底层的丰度最高,与亚硝酸盐氧化速率检测结果一致。nxrB的基因丰度略高于aclA的基因丰度,但两者仍处于同一数量级,而nxrB基因的转录子丰度远高于aclA基因的转录子丰度,说明亚硝酸盐氧化基因的表达活性较高,而固碳基因的表达活性低。Pearson相关分析结果显示 Nitrospinaceae nxrB、Nitrospinaceae+Nitrospira nxrB、Nitrospinaceae aclA和Nitrospira aclA四个功能基因的丰度以及Nitrospinaceae+Nitrospira nxrB、Nitrospinaceae aclA的基因转录子丰度均与亚硝酸盐氧化速率有显著正相关关系(P<0.05),Nitrospinaceae nxrB的基因转录子丰度与亚硝酸盐氧化速率有趋近显著的正相关关系(P=0.066)。PCoA和Jackknife clustering分析结果表明,NOB的群落结构和活性与水深相关,表层的5 m和中深层的200 m及以下层位有相似的NOB群落结构,且活性低;次表层有相似的NOB群落结构,且活性高。表层、中深层与次表层的NOB群落结构和活性差异大。CCA 分析结果中,Nitrospinaceae nxrB 基因、Nitrospinaceae+Nitrospira nxrB基因和Nitrospinaceaae alcA基因转录子的CCA分析都显示水体溶解氧浓度(DO)与南海北部海水中NOB的群落结构和空间分布显著相关,这说明DO对海洋NOB有很大的影响,研究表明Nitrospinaceae和Nitrospira均是微需氧细菌,因此太高浓度的DO对这两类NOB有抑制作用。Nitrospinaceae+Nitrospira nxrB基因的CCA分析显示盐度(Salinity)也与NOB的群落结构和空间分布显著相关。Nitrospira aclA 基因、Nitrospinaceae nxrB 基因转录子、Nitrospinaceae+Nitrospira nxrB基因转录子的CCA分析显示NO3-与南海北部海水中NOB的群落结构和空间分布显著相关,NO3-是亚硝酸盐氧化的产物,这也说明南海北部海水中的NOB具有活性,与较高的亚硝酸盐氧化速率一致。NitrospinaceaeaclA基因的CCA分析显示水深(Depth)也与南海北部海水中Nitrospinaceae的群落结构和空间分布显著相关,不同水深光照强度、温度和底物浓度都不同,这些都对NOB有较大的影响。Pearson相关分析显示,氨氧化速率与NH4+、NO2-、Chl-α有显著的正相关关系,亚硝酸盐氧化速率与DIC有显著的正相关关系。Nitrospinaceae nxrB、Nitrospinaceae+Nitrospira nxrB、Nitrospinaceae aclA和Nitrospira aclA 四个功能基因的丰度都与DIC有显著的正相关关系,DIC是NOB进行固碳作用的底物,说明南海北部海水中的NOB有固碳活性。Nitrospinaceae nxrB、Nitrospinaceae+Nitrospira nxrB、Nitrospinaceae aclA三个功能基因的转录子丰度与Salinity有显著的正相关关系。Nitrospinaceae nxrB、Nitrospinaceae+Nitrospira nxrB和Nitrospinaceae aclA三个功能基因的相对丰度与 Depth、Eh、SiO32-、PO43-、NO3-和DIN有显著的正相关关系,与温度、DO、pH和DOC有显著的负相关关系。Nitrospira aclA基因的相对丰度与Eh、N03-和DIN有显著的正相关关系,与温度、pH和DOC有显著的负相关关系。CCA分析和Pearson相关分析结果都表明N03-、Salinity、DO、Depth、DIC是与南海北部海水中NOB的群落结构、空间分布、丰度和活性最相关的环境因子。