研究背景发热伴血小板减少综合征(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome,SFTS)是一种新发的病毒性蜱媒传染病,该疾病于2009年首先在中国内陆地区被发现,病原体被确证命名为严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV),是一种新型的布尼亚病毒。截止到2017年初,在中国共有23个省份有相关病例报道,平均死亡率约为5.3%。世界卫生组织已连续数年将其列入年度优先关注的十大疾病之中(WHO disease priority blueprint)。然而,对此病毒的致病机制以及病毒宿主间相互作用的认识还比较匮乏。其中因血小板严重减少导致的出血倾向和免疫抑制引起病毒的持续复制被认为是SFTS的两大重要特征和致死因素。研究目的本研究旨在利用代谢组学分析SFTSV对宿主病人代谢的影响,发现并验证潜在异常的代谢途径及其生物学效应,后利用临床随机对照试验和体外细胞模型对病毒引起的代谢异常及其生物学效应进行验证。从而探究该病毒的发病特征和致病机理,并为后续临床应用筛选可能的生物标志物和治疗靶点。研究方法和技术手段本研究第一部分利用基于LC-MS/MS的靶向代谢组学技术对来自两个人群的独立样本进行了血清代谢组学分析。第二部分采用病例对照的组间比较,并运用全自动氨基酸谱分析、流式细胞术、酶联免疫吸附试验、Primeflow原位RNA检测等技术手段对精氨酸代谢异常及其生物学效应进行关联分析及生物学效应分析。第三部分采用临床随机对照试验,沿用第二部分的技术手段,对精氨酸的生物学效应及其干预效果进行了验证。最后两部分回顾性分析了SFTS病例中内皮细胞功能相关的临床特征并依靠所构建的体外细胞感染模型,利用激光共聚焦显微镜、荧光定量PCR、Transwell细胞培养小室、Luminex液相芯片等技术,从临床和体外两个方面对精氨酸代谢异常可能瞄准的另一靶标:血管内皮细胞功能障碍进行了验证。研究结果一、发热伴血小板减少综合征代谢组学关联研究在第一组和第二组人群中分别检测到63种和103种代谢物的相对丰度。采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),发现主要差异代谢物可将各组人群进行较好区分。根据统计分析结果在第一组和第二组人群中分别筛选出28个和41个差异代谢物,共有54种差异代谢物。通过代谢通路分析发现了数条有显著意义的代谢通路。其中,精氨酸,脯氨酸代谢通路同时具有最高的通路影响因子(Pathway impact)且具有显著的统计学意义(P<0.001)。此外,精氨酸相关代谢物浓度与临床预后密切相关。二、精氨酸代谢异常的病例对照组间比较与生物学效应分析在研究第二部分验证人群的病例对照组间比较中,精氨酸和瓜氨酸在感染急性期发生显著降低(P<0.001),鸟氨酸明显上升。整体精氨酸的生物利用度(GABR)显著下降,且在死亡病例中尤为明显。同时,与精氨酸代谢关系密切的骨髓源性抑制细胞的比例及其胞内精氨酸酶的表达明显上升(P<0.001),受精氨酸调控的T细胞受体CD3ζ链在CD4淋巴细胞亚群发生明显下调(P<0.001)。精氨酸在血小板内的代谢产物血小板一氧化氮发生显著下调(P<0.001)。这些因素与精氨酸水平呈现明显相关关系,并与血小板数量、病毒载量等临床表型密切相关。因此,推测精氨酸下降可能与免疫抑制和血小板减少的调控的有关,并引起了相应的临床改变。三、精氨酸干预发热伴血小板减少综合征的随机对照试验结果表明,在精氨酸用药组人群中,血小板一氧化氮明显上升,T淋巴细胞CD3ζ链上调,病毒清除和血小板恢复速度加快。四、发热伴血小板减少综合征内皮细胞损伤的回顾性分析及病例对照研究结果显示,18.3%的SFTS患者在感染期间出现了渗漏症状,32.3%的患者出现出血症状,均为血管内皮细胞损伤的主要临床表现,SFTS患者血清中的多种粘附因子浓度发生显著上调,提示内皮细胞激活和炎症反应发生的可能。五、发热伴血小板减少综合征内皮细胞损伤的体外实验研究在体外内皮细胞感染模型中,病毒感染可直接引起血管内皮细胞形态学、细胞表面激活分子表达增强、细胞因子分泌增加、细胞活性下降、细胞跨膜电阻下降和大分子通过率上升、细胞连接蛋白和骨架蛋白表达改变等多方面变化。研究结论研究发现精氨酸代谢异常是发热伴血小板减少综合征中重要的致病特征,并因精氨酸具有免疫调控,血小板抑制和血管内皮稳定性调节等多方面的生物学作用,而与发热伴血小板综合征中的各个关键性临床病理变化密切相关。精氨酸及其相关代谢物具有作为预后判断的生物标志物和辅助治疗药物的潜力。研究意义与创新性发热伴血小板减少综合征是一种高发于中国内陆省份并在全球多地均有报道的新发致死性传染病,且因蜱虫的分布导致该疾病的易感人群多为偏远山区的农村人口,而近十年来该疾病的持续流行给我国的医疗卫生系统带来了沉重的负担,并不断威胁着全球的公共卫生安全。但是该疾病既无有效的治疗手段和疫苗,对它的发病机理也缺乏清晰的认识。本研究首次从代谢角度出发对发热伴血小板减少综合征这一新发病毒性传染病进行了系统性分析,发现并验证了发热伴血小板减少综合征中精氨酸代谢异常的特征性变化及其相关生物学效应。为该疾病的预后判断,发病机制,临床治疗带来了全新的视角;并且拓宽了精氨酸在急性病毒性传染病中的认识和应用。