研究背景及研究目的：特发性脊柱侧凸(Idiopathic Scoliosis简称IS)是一种以脊柱冠状面侧凸,伴椎体旋转的脊柱三维畸形。特发性脊柱侧凸病因不明,既往的研究集中在软骨、骨骼、关节、神经肌肉等组织学因素的致病机制上,但没有肯定的结果。近年的大量研究认为遗传因素在其发病中起重要作用,并表现出高度的遗传异质性,即在一些IS家系中存在主效基因,表现为常染色体显性遗传,而另一部分家系中没有主效基因,显示出多基因遗传的特征。常见报道有常染色体显性遗传模式,X连锁显性遗传模式,以及多基因遗传模式。我们采用遗传流行病学的方法,对在西南医院手术治疗的214例IS患者及其家系展开调查,通过年龄、发病率、家族聚集性、遗传度和各种遗传病的特点分析确定遗传因素的作用和遗传模式,取得肯定的结论。目前采用候选基因策略克隆法研究IS的易感基因有褪黑素受体1A基因,褪黑素受体1B基因,Matrilin-1(MATN1)基因,γ-1-syntrophin(SNTG1)基因,胶原COL1A1,胶原COL1A2、COL2A1、弹性纤维、原纤维蛋白,以及聚蛋白多糖等。这些结果都显示与IS有一定的相关性,但不能普遍适用于所有的IS患者。采用定位克隆策略研究结果显示IS易感基因的定位区域有：6p、10q、18q,6p、6q、17p11.2,8q,9q、16q,19p13,19p13.315q25-26,9q31.2,-9q34.2、17q25.3-qtel,12p, Xq23-26。虽然这些实验明确定位IS易感基因存在于染色体的特定区域,但这些区域内仍包含数以百万计的碱基对,存在成百上千的已知基因,具体哪个是IS的易感基因,还需要大量研究工作。到目前为止CHD7是唯一的通过定位克隆法研究定位的IS的易感基因。通过对定位克隆策略研究的文献复习,我们发现有2位学者将疾病基因位点定在19p13。Chan不仅定位在19p13.3内,还进一步的精确定位于D19S216标志附近,在D19S894-D19S1034之间,我们在Chan的研究结果的基础上做进一步的定位候选克隆法研究,经检索Human Genome Organisation(HUGO)所属的HUGO Gene Nomenclature Committee(HGNC)网站,2009年4月为止,在19P13.3区域内共有213个已知基因。我们在染色体19p13.3区域内,筛选出D19S216标志附近与组织结构、功能有关的SH3GL1,GADD45B, FGF22为IS候选基因,设计以家系为基础的“病例同胞对对照,病例亲属对对照”研究方案,并根据SH3GL1, GADD45B, FGF22基因的外显子设计引物对进行PCR扩增、克隆和测序,进行“同胞对、亲属对”之间的序列比对和蛋白质结构预测分析。研究方法：1.遗传流行病学调查：采用自行设计的IS遗传流行病学调查表,由经过培训的调查员对先证者家系进行调查,绘制家系谱。调查方法为门诊、病房面对面询问和电话询问相结合(先告知调查目的征得知情同意)。调查对象为AIS先证者、父亲和母亲。详细调查先证者的一级亲属有：先证者的同胞、双亲和先证者的子女；先证者的二级亲属有：先证者祖父母、外祖父母、姨、姑、舅和叔伯；三级亲属有：先证者的表兄妹、堂兄妹。流行病学常规调查内容有：一般情况、有无脊柱侧凸病史。对怀疑为易感者和AIS受累者的家系成员,需要行临床物理检查确定：包括脊柱视诊、Adam弯腰试验以及脊柱正位X线片检查。AIS的诊断标准：受试者直立冠状位X线片检查：如果Cobb角>10°为受累者,年龄小于14岁的表型正常的家系成员,统计时属于未发病的亲属。遗传流行病学的统计学分析：家族聚集性分析使用样本率与总体率比较U检验,AIS遗传度用Falconer回归法估算。2.定位候选克隆筛查易感基因,我们在染色体19p13.3区域内,筛选出D19S216标志附近与组织结构、功能有关的SH3GL1, GADD45B, FGF22为AIS候选基因,设计以家系为基础的“病例同胞对对照,病例亲属对对照”研究方案,并根据SH3GL1, GADD45B, FGF22基因的外显子设计引物对进行PCR扩增、克隆和测序,进行“同胞对、亲属对”之间的序列比对和蛋白质结构预测分析。研究结果：1、遗传流行病学的研究调查结果：成功设计AIS遗传流行病学调查表,对214个家系展开遗传流行病系统调查。数据统计结果：家系成员AIS发病年龄在3-20岁,78.91%在10～14岁之间,平均11.8岁。男：女=1：2.59,女性发病高于男性。调查家系总发病率11.74%。AIS一级亲属的发病率10.01%>二级亲属的发病率2.55%>三级亲属的发病率1.04%。用Falconer|阈值法计算IS遗传度：AIS一级亲属遗传度h12为(77.68±10.39)%,二级亲属遗传度h22为(69.89±3.14)%,三级亲属遗传度h32为(62.14±11.92)%。一级、二级、三级亲属的遗传度h2的加权均值h12h22h32为(49.17±2.92)%。2、候选基因序列对比分析：候选基因SH3GL1, GADD45B, FGF22中的外显子成功克隆及扩增。SH3GL1基因包括10个外显子,各个外显子克隆序列比对分析可见56例患者及93例对照亲属SH3GL1基因均有突变位点,共发现12处等位基因存在变异,分别位于第2、4、5、6、8、10外显子处。其中10处变异均位于编码区,2处变异位点(均在第10外显子上)位于非编码区。GADD45B基因4个外显子的克隆序列比对分析发现2处等位基因存在变异,分别位于第3、4外显子处。FGF22基因3个外显子的克隆序列比对分析发现1处等位基因存在变异,分别位于第2、3外显子处。3、蛋白质序列预测分析93例亲属对照者中均为CC,56例先证者中有5例(8.93%)样本中等位基因为TT,他们的编码区mRNA序列与美国国立生物技术信息中心序列相同。样本为女性先证者和其母亲(Is患者),女性先证者和其父亲(IS患者),及一名男性先证者,其余51例(91.07%)为CC),他们的SH3GL1的编码区mRNA序列与NCBI序列相比有差异。如果先证者基因在515位碱基由C突变为T,既CAG突变为TAG,则形成终止密码子(TAG),蛋白阅读框发生改变。研究结论：1.AIS是多基因遗传病：家系成员AIS发病年龄在3-20岁,78.91%在10-14岁之间,平均11.8岁,为早发疾病,提示遗传性疾病的可能性大。调查家系总发病率11.74%与参照人群发病率1.04%比较有显著性差异,提示IS有家族聚集性。而且先证者一级亲属发病率>二级亲属发病率>三级亲属发病率,即与先证者的亲缘关系越近,发病率越高,有明显的家族聚集性倾向；虽然具有明显的家族聚集性,但不符合孟德尔遗传法则,结果表明本研究的特发性脊柱侧凸病例不属于单基因遗传病。先证者各级亲属遗传度均大于60%,说明遗传因素在IS发病中起着重要的作用。综合上述结果认为AIS是多基因遗传病。2. SH3GL1是AIS的候选的致病基因：候选基因SH3GL1, GADD45B, FGF22中的外显子碱基序列对比,分析后发现绝大部分外显子区域均有碱基突变,但大部分碱基突变并未影响氨基酸的翻译。只有在少数AIS患者SH3GL1基因,在第515位的碱基由C突变为T,既CAG突变为TAG,而TAG为终止密码子,在蛋白质翻译过程中终止肽链合成。蛋白翻译时,终止密码子使开放阅读框改变,而出现翻译的肽链缩短,使肽链的一级结构发生改变。基因SH3GL1其余突变位点,及基因GADD45B, FGF22的突变位点,均未影响翻译氨基酸改变。由此可以证明基因SH3GL1可能是AIS疾病候选基因之一。