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研究目的:血液循环的重建是治疗心肌梗死(myocardial infarction,MI)的有效方法。据报道,源自血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的特异性血管生成肽(VEGF mimic peptides,VMP)可以激活其受体,具有与VEGF相似的促进血管生成的活性。然而,它是否可在心肌梗死的治疗中发挥有效作用并不清楚。在本研究中,为了提高在缺血区的有效治疗浓度,我们构建了可与胶原蛋白特异性结合的靶向肽CBD-VMP肽,该靶向肽由于胶原结合域(collagen binding domain,CBD)的存在可与胶原特异性结合而不影响VMP的促进血管生成作用。随后,我们将其与脱细胞的心脏细胞外基质(cardiac extracellular matrix,c-ECM)胶原蛋白水凝胶结合后,共同注射到大鼠心肌梗死部位,研究CBD-VMP/c-ECM胶原蛋白水凝胶在心肌梗死中的治疗效果。研究内容和方法:1.通过一系列脱细胞基质操作获得可注射的c-ECM凝胶,并使c-ECM凝胶与胶原蛋白凝胶以1:1的比例混合得到c-ECM胶原蛋白水凝胶。2.利用MTT的方法检测CBD-VMP肽和VMP肽的生物学活性。3.利用ELISA检测多肽与脱细胞基质胶原蛋白水凝胶的结合能力。4.通过大鼠皮下移植,观察CBD-VMP肽结合胶原支架材料在体内能否有效促进血管生成。5.心肌梗死动物模型的制备及心肌内注射治疗。6.通过TTC染色法验证心肌梗死模型的制备是否成功。7.超声心动图进行整体心脏功能测试。8.通过组织学染色法和免疫荧光染色法,进行梗死区周围血管生成和心肌细胞凋亡检测。研究结果:1.猪左心室组织脱细胞处理,制备脱细胞的c-ECM。通过扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察显示为多孔结构,且平均孔径为100-200μm,可促进细胞和营养物质的渗透。并按所述方法制备了c-ECM胶原蛋白水凝胶。2.通过MTT方法得到CBD-VMP和VMP肽与VEGF的生物活性相似。结果表明相同浓度之下,三者之间无显着差异,这与其他报道一致。此外,CBD-VMP和VMP在各种浓度下都具有相似的生物活性,即促进HUVEC的增殖。3.ELISA检测发现含有胶原结合肽的CBD-VMP能更好的与脱细胞基质胶原蛋白水凝胶结合。结果显示随着CBD-VMP和VMP的浓度上调,与VMP相比,更多的CBD-VMP保留在脱细胞基质胶原蛋白水凝胶上。4.将各种肽加载到胶原蛋白支架上,并进行大鼠皮下移植。植入两周后显示,CBD-VMP/胶原组有更多的细胞浸润和血管形成,同时HE染色也证实了这些结果。此外,α-SMA是血管的特异性标志物,VMP和CBD-VMP肽均可诱导更多的血管生成。但CBD-VMP肽能特异性与胶原蛋白支架结合,促进血管生成更为显著。5.梗死区心脏组织做TTC染色后,主要分为两部分:红色为非梗死区,白色为梗死区,证明大鼠心肌梗死模型制备成功。6.超声心动图表明促进血管生成能有效促进心脏功能恢复。统计发现CBD-VMP/c-ECM胶原蛋白水凝胶组的射血分数(ejection fraction,EF)和缩短分数(fractional shortening,FS)与对照组相比出现明显差异。此外,在这三组中,其他超声心动图指标没有显著差异,包括舒张期和收缩期的左心室内径(分别为LVIDd和LVIDs)、舒张期和收缩期左心室后壁厚度(分别为LVPWd和LVPWs)。7.术后三个月,取材,切片,并进行免疫荧光染色。α-SMA染色发现CBD-VMP/c-ECM胶原蛋白水凝胶组与VMP/c-ECM胶原蛋白水凝胶组再生的血管数目明显增加;TUNEL染色显示在CBD-VMP/c-ECM胶原蛋白水凝胶组中TUNEL阳性细胞核数显著的减少,说明CBD-VMP/c-ECM胶原蛋白水凝胶可以减轻MI后的细胞凋亡并保护心肌细胞。以上结果提示:CBD-VMP/c-ECM胶原蛋白水凝胶促进MI大鼠血管再生的同时保护了心肌细胞。结论:综上所述,CBD-VMP肽和可注射的c-ECM胶原蛋白水凝胶的组合可以有效地增加血管生成,减少心肌细胞凋亡,以此促进心肌梗死大鼠心脏功能的恢复。