【摘 要】
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OAS/RNase L信号通路是最早被发现的由干扰素所诱导的抗病毒途径之一,在高等脊椎动物的先天性免疫识别中发挥着至关重要的作用。该信号通路的特点在于可以直接降解多种病毒或者宿主细胞RNA。当RNA病毒入侵机体时,刺激干扰素的分泌,进而诱导宿主细胞内寡聚腺苷酸合成酶(OAS)的表达。OAS被病毒基因组RNA的双链区域(dsRNA)激活,催化ATP合成2’-5’磷酸二酯键连接的寡聚腺苷酸(2-5A)
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OAS/RNase L信号通路是最早被发现的由干扰素所诱导的抗病毒途径之一,在高等脊椎动物的先天性免疫识别中发挥着至关重要的作用。该信号通路的特点在于可以直接降解多种病毒或者宿主细胞RNA。当RNA病毒入侵机体时,刺激干扰素的分泌,进而诱导宿主细胞内寡聚腺苷酸合成酶(OAS)的表达。OAS被病毒基因组RNA的双链区域(dsRNA)激活,催化ATP合成2’-5’磷酸二酯键连接的寡聚腺苷酸(2-5A)。2-5A结合细胞质中的核糖核酸酶L(RNase L),使其由非活性的RNase L单体聚集组装为具有活性的同源二聚体,进一步降解病毒或宿主的单链RNA,抵御病毒感染。与此同时,一些病毒进化出了逃逸OAS/RNase L信号通路的策略。研究发现,口蹄疫病毒的前导病毒蛋白酶(FMDV L)可以直接与猪源RNase L(sRNase L)的N端锚蛋白重复序列(ANK)结合阻止其二聚体的形成,从而逃逸先天性免疫;但不能抑制人源RNase L(hRNase L)的活性。目前,尽管人源和猪源RNase L活化后的二聚体结构已经被解析,多个FMDV L的三维结构也已发表,但对于FMDV L抑制RNase L二聚的结构基础尚不明确,本论文拟通过X-射线晶体学研究RNase L与FMDV L相互作用的分子基础,为研发抗口蹄疫病毒药物提供新的思路。研究内容和结果如下:1)在分子水平上构建hRNase L、sRNase L以及FMDV L的体外重组克隆。2)在大肠杆菌细胞中表达,并通过一系列层析纯化方法,筛选获得性质均一、高纯度的 hRNase L-ANK、sRNase L-ANK、sRNase L 全长(sRNase L-FL)以及FMDVL可溶蛋白,并尝试hRNase L-FL蛋白的表达纯化。3)利用OAS合成2-5A,并用高效液相色谱(HPLC)制备纯化,再通过凝胶过滤层析验证sRNase L-ANK与2-5A之间的相互作用,并利用HPLC定性分析了 sRNase L-FL的催化活性。4)通过凝胶过滤层析以及等温滴定量热(ITC)实验,分析sRNase L-ANK与FMDV L之间的相互作用。5)通过蒸汽扩散结晶法,初筛适合hRNase L-ANK、sRNase L-FL以及sRNase L和FMDV L复合物晶体生长的条件,并进一步优化。获得了一种FMDVL新的二聚体结构,并为设计新型FMDV L抑制剂提供了结构基础。
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