前言：　　 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性进行性自身免疫性疾病,以关节滑膜炎及对称性关节骨、软骨破坏为主要特征。RA的发病率在我国约为0.4%,其第一个5年致残率达30%,平均缩短寿命5～7年,已经成为一种严重威胁人类健康的疾病。近年来发现RA滑膜细胞在类风湿关节炎发挥主要的作用,特别是分泌一些细胞因子像IL-1,TNF-α,聚蛋白多糖酶等诱导关节炎症的发生和关节软骨的破坏。而且这些炎性因子之间相互作用,呈级联放大作用,促成关节炎症的不断加重。所以寻求一种良好的治疗方法成为现在学者研究的焦点。　　 生长因子蛋白激活激酶(TAK1)属于MAPKKK家族,能被多种细胞因子包括IL-1β,IL-18,TNF-α等激活。细胞因子与膜受体结合后,通过TAK1磷酸化并激活MAP2Ks家族的MEK3/6和MEK4/7,随后MEK3/6和MEK4/7分别激活MAPK家族的P38激酶、应激活化激酶(JNK)进而激活转录因子激活蛋白1(AP-1)。此外TAK1还能激活IKK,从而使NF-κB进入细胞核中,参与基因转录。转录因子AP-1和NF-κB能上调多种RA发病中的重要基因产物表答,如基质金属蛋白酶(MMPs)、环氧化酶2(COX-2)和多种细胞因子。其中MMPs可导致关节破坏;COX-2增加前列腺素生成,导致疼痛和持续滑膜炎症;细胞因子刺激周围的滑膜细胞产生更多的炎性因子,形成正反馈机制使RA病情不断持续和进展。目前已有研究表明在骨性关节炎软骨细胞中TAK1大规模的表达,并且阻遏TAK1基因可以使其下游炎性因子表达减少。我们所作的前期工作已经证实了TAK1在RA病人滑膜中有较高水平的表达和活性,因此推断TAK1可能在RA发病中起重要作用,阻断TAK1将有助于降低致炎性细胞因子对RA关节和滑膜的影响,TAK1可以作为RA基因治疗中的一种新的靶基因。　　 金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)是MMP的特异性抑制剂,在ECM代谢调节中是与MMP对应的负调节剂。主要由氨基末端和羧基末端结构域来维持自身的稳定性,目前已明确的TIMP主要有四种即TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。其中TIMP1能抑制绝大多数MMP可与MMP9前体及有活性的MMP1、3、9形成高度亲和的、非共价键结合的复合物。TIMP在组织中的主要作用是调节蛋白水解和抗水解作用之间的平衡,进而维持细胞外基质的稳定性。MMP与TIMP之间维持一种平衡的关系,一旦这种关系被打破就会导致细胞外基质分解和组织结构的重朔。TIMP1与TIMP家族中其他的成员不同,并没有明确的特异性。它既可以抑制大多数MMP酶类,也可以抑制人金属肽酶含血小板反应蛋白(ADAMTS)像ADAMTS-4和ADAMTS-5。目前已有研究证实重组的人TIMP1可以明显抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5,这种抑制作用甚至强于对MMP的抑制。TIMP1可以在发育的胚胎细胞、正常的人软骨和滑膜细胞中表达,在关节炎滑膜细胞中表达会上调。另外在体外培养的滑膜成纤维细胞和软骨细胞中可被转化生长因子上调。IL-1也可更进一步放大TIMP1的分泌。　　 基质金属蛋白酶(MMP)是关节软骨中降解聚蛋白多糖和胶原的主要酶类,MMPs是在聚蛋白多糖核心蛋白的球间区(IGD)Asn3412Phe342位点裂解聚蛋白多糖,产生的聚蛋白多糖片段分别为G12DIPEN和FFG。MMP家族在类风湿关节炎的软骨、滑液、滑膜均有明显的增高趋势,它主要通过炎性通路被上游的介质激活。大量的研究证实MMP在RA的诊断中具有重要的意义。MMP与TIMP之间维持一种平衡的关系,特别是TIMP1与MMP9特异结合,抑制后者的降解作用。同时又受转化生长因子激活激酶的调节,TAK1激活JNK诱发MMP1基因表达导致关节炎的发生。MMPs可降解细胞外基质的内肽酶,其可降解关节骨与软骨中的胶原、蛋白多糖及其他的基质大分子,从而促进血管翳对软骨的侵蚀。故而滑膜中的成纤维样细胞来源的MMPs是导致关节病理损伤的重要因素。并有报道滑膜的过度生长引发致炎细胞因子及基质金属蛋白酶的产生。正常滑膜被覆细胞、RA患者滑膜A型细胞基本上不能合成或很少合成MMPs,在RA过程中,增生的B型滑膜细胞可能在巨噬细胞分泌的IL-1、TNF-α等细胞因子刺激下,持续合成和分泌酶原形式的MMP-3。在血浆激肽释放酶、纤溶酶或组织蛋白酶G等的作用下,转化为具有活性的MMP-3,并激活滑膜被覆细胞分泌的胶原蛋白酶原,进而引发MMPs家族其他成员活化。Gravallese利用原位杂交测定MMPs的RNA,发现MMP-3在滑膜组织中过度表达,且滑液中含有大量MMP-3;另外,对RA患者滑液中蛋白多糖、核心蛋白的分析表明,他们在原位被MMP-3所清除。1987年Okada研究发现,RA患者的关节液中MMP-1,MMP-2,MMP-3显著增高,对关节结构有明显破坏作用,早期RA血清中MMP-1,MMP-2的表达水平与疾病的活动性和预期的功能损害及X线表现呈正相关。通过对307例临床患者研究发现,患者关节液中MMP-3浓度显著增高可以作为RA的早期诊断和治疗观察指标之一,尤其在血清阴性患者中适合。基因研究发现,MMP-3的基因多态性与RA的严重性相关,而不是与RA是否发生相关,研究这种多态性有助于早期预见RA的严重程度。虽然发现血清MMPs水平与疾病的活动相关,但在疾病开始的时候血清pro-MMP-3高水平表达预示疾病的进展可能比较严重。　　 材料与方法：　　 一、实验材料　　 1、11例滑膜组织标本来源于2009年11月-2010年12月中国医科大学附属第一医院骨科住院患者。所有患者诊断均符合美国风湿病学会1987年提出的诊断标准,术前均经伦理学认证。RA患者男4例,女7例,年龄50-64岁,平均(56.2岁)。　　 2、免疫组化染色试剂盒　　 3、Real-timePCR反转录试剂盒　　 4、DharmaFECTsiRNA转染试剂盒　　 实验方法　　 1、细胞培养　　 RA患者滑膜细胞在DMEM培养基和10%胎牛血清中于37℃、5%CO2条件下进行培养。细胞单层生长达80-85%培养面积后,用于实验或传代。　　 2、细胞鉴定　　 将培养至三代的滑膜细胞做免疫组化鉴定,取出贴满细胞的盖玻片,10%甲醛溶液固定30min。晾干后PBS冲洗三次,加入3%H2O25-10min,PBS冲洗后,加入正常善养血清,室温静置10-15min,倾去、勿洗、甩干,加一抗过夜。滴加辣根过氧化物酶,室温孵育10min,PBS冲洗3×3min,DAB显色。显色完全后复染、脱水、封片。　　 3、细胞转染　　 取对数生长期的滑膜细胞种植于六孔板中,种板浓度3*105/孔。从六孔板中移除培养基,随机将培养的滑膜细胞分为阴性对照组,实验组。严格按照试剂说明书规定,每孔加入2mL配制好的FECT(含特异性siRNA)转染液,培养细胞37C°、5%CO2孵箱中24h,用于mRNA分析。　　 4、实时荧光定量PCR检测　　 提取RNA前半小时加入IL-1β置于孵箱中反应。吸尽6孔板中的转染液,加入1mLTrizol,室温静置5min。氯仿0.2mL/mLTrizol,1000转离心15min,将水相移入新管。异丙醇沉淀RNA,清洗完毕后加入反应体系反转。PCR反应总体积25μL,其中SYBRPremixEx.TaqTM2×12.5μL、上、下游引物各0.5μL,三蒸水9.5μL,模板2μL。　　 5、统计学分析　　 统计学处理采用SPSS16.0统计分析软件,计量资料描述用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果：　　 TAK1siRNA对RA患者滑膜细胞中mmp9和timp1表达的影响。　　 本研究发现运用转染技术高效抑制TAK1在RA滑膜细胞中的表达,real-timePCR发现timp1和romp9的表达不同程度的降低。两者之间的下调比例存在明显的不匹配关系。有统计学意义(P<0.05)。　　 结论：　　 1、通过在RA患者滑膜细胞中转染TAK1siRNA后可抑制MMP9的表达。　　 2、通过在RA患者滑膜细胞中转染TAK1siRNA后可抑制Timp-1的表达。　　 3、转染前后RA患者滑膜细胞MMP9和Timp-1比例下降差异明显,打破两者之间的平衡关系。