我省是食管癌高发区，目前食管癌的早期诊断滞后，发现时，中晚期病人居多，许多患者失去了手术根治的机会。70～80％的患者需行放射治疗。但常规放疗的5年生存率仅达10～20％左右，放疗后局部复发致死率高达60％～80％。从分子生物学水平探索放射敏感性、放疗疗效的生物学机制，寻求分子水平的治疗手段，可以从根本上改善食管癌放射敏感性和放疗疗效，使食管癌患者获得长期生存。Survivin基因具有调节细胞凋亡和细胞周期的双重作用，大量研究揭示了它与肿瘤细胞凋亡、细胞周期调控和放射敏感性之间的密切关系。本研究试图从细胞水平和临床水平两方面探索survivin基因与食管癌放射敏感性的关系，并尝试通过抑制survivin基因的表达提高食管癌的放射敏感性，改善食管癌的放疗疗效。本研究分为如下三个部分：第一部分为研究食管癌不同放射敏感性细胞株间survivin基因的表达是否存在差异，以及在细胞受到照射后survivin基因表达量的变化。目的是初步探索survivin基因是否参与了放射敏感性的调节。第二部分为采用survivin反义寡核苷酸转染人食管癌Eca-109细胞，观察它对细胞生长和放疗敏感性的影响。目的是通过反义寡核苷酸的方式，对survivin基因高表达的细胞株Eca-109的survivinmRNA进行封闭，一方面进一步探索survivin基因与放射敏感性之间的关系，另一方面尝试以survivin基因为靶点的基因治疗对肿瘤细胞的抑制作用和对辐射的增敏作用。第三部分为Survivin在食管鳞癌放射治疗中的临床意义。 第一部分Survivin基因在食管癌不同放射敏感性细胞株间的表达差异目的：食管癌目前的放射治疗效果较差，急待提高。随着分子生物学的迅猛发展，从分子水平探索食管癌放射敏感性的机制，是提高放射治疗疗效的关键。研究表明放射敏感性与凋亡和细胞周期密切相关，survivin基因是重要的凋亡抑制基因，具有调节细胞凋亡和细胞周期的双重作用，已有研究表明survivin基因与肿瘤细胞的放射敏感性密切相关。本研究通过对食管癌不同放射敏感性的细胞株TE-13和Eca-109的survivin基因的研究，试图初步揭示survivin基因与食管癌细胞凋亡、细胞周期调控和放射敏感性之间的关系。 方法：采用克隆形成实验研究了人食管癌细胞株TE-13和Eca-109的放射敏感性的差异。用流式细胞技术分析了TE-13和Eca-109细胞照射前后细胞周期、凋亡变化的不同特点，并用RT-PCR、Western-blot和流式细胞检测方法研究了伴随的survivinmRNA和蛋白表达量的改变。 结果：1、克隆形成实验结果：TE-13细胞的D0值为2.15Gy，SF2值为0.748。Eca-109细胞的D0值为2.70Gy，SF2值为0.785。两种细胞的D0值和SF2值显示Eca-109细胞相对于TE-13细胞，表现为放射抗拒。2、照射前TE-13细胞和Eca-109细胞的自发凋亡率相似3、Survivin基因的mRNA和蛋白表达水平在照射前两种细胞没有明显差异，照射后蛋白表达逐渐升高，TE-13细胞在48h开始下降，而Eca-109细胞持续增高，照射后48h和60h显著高于TE-13细胞(P＜0.05)。 结论：本研究通过克隆形成实验证实人食管癌细胞株TE-13和Eca-109具有不同的放射敏感性。通过对这两种细胞照射前、后细胞周期、凋亡以及survivin基因表达量变化的分析认为：不同放射敏感性的食管癌细胞株，8Gy照射后survivin基因的蛋白表达水平不同，G2/M期阻滞的程度和放射诱导的凋亡率也不同，推测survivin基因参与了细胞照射后G2/M期阻滞，抑制了放射诱导的凋亡发生，从而影响了食管癌细胞的放射敏感性。为进一步研究提供了实验依据。 第二部分Survivin反义寡核苷酸转染Eca-109细胞对放射敏感性的影响 目的：食管癌在我国为高发恶性肿瘤，治疗效果较差，局部控制率低是致死的主要原因。放射治疗作为局部治疗的重要手段，疗效急待提高。肿瘤分子生物学为肿瘤的放射治疗从分子水平解释和认识提供了理论依据，其中基因调控与放射敏感性关系的研究，为恶性肿瘤的放射治疗提供了新的思路和方法。研究表明，放射敏感性与细胞周期调控和细胞凋亡密切相关，通过改变基因或其表达调节肿瘤细胞的放射敏感性，是近年来非常有前景的课题。Survivin基因是IAP家族成员之一，其特点：一是在肿瘤中高特异的表达，二是参与凋亡及细胞周期调节的重要功能，因而有望成为基因治疗的靶点。已有研究报告了survivin基因影响肿瘤细胞对放化疗的敏感性。 方法：以Lipofectmine2000为载体，对survivin基因高表达的Eca-109细胞进行survivinASODN转染，荧光显微镜观察转染效率，以RT-PCR、Western-blot和流式细胞检测方法检测了基因转染后对survivinmRNA和蛋白表达量的抑制。 结果：1)采用Lipofectmine2000为载体，将survivinASODN转染入Eca-109细胞，荧光显微镜观察到较高的转染效率。并且转染持续72h无变化。RT-PCR法检测转染前后survivinmRNA含量，转染后下降约3-4倍，差异显著(P＜0.05)。3)转染survivinASODN后的Eca-109细胞，经8Gy照射后G2/M期阻滞由照射后24h时的68.0±3.4％下降至42.2±3.8％，凋亡增多至12.5±3.0％(P＜0.05)。MTT实验检测转染加8Gy照射组细胞的生长抑制率为67.0±1.5％，单纯照射组为55.6±7.1％，有显著差异(P＜0.05)。 结论：1)采用以Lipofectmine2000为载体的survivinASODN转染Eca-109细胞，可以有效抑制survivin基因在RNA水平和蛋白水平的表达。2)survivinASODN对人食管癌细胞Eca-109的生长具有明显的抑制作用和促进细胞凋亡作用。3)转染survivinASODN后的Eca-109细胞，8Gy照射后G2/M期阻滞程度下降，凋亡增多，细胞的放射敏感性提高。 第三部分Survivin在食管鳞癌放射治疗中的临床意义目的：Survivin基因具有与肿瘤的发生、发展关系密切的重要功能，并且参与了多种肿瘤的放射抗拒。研究认为survivin基因还与肿瘤的血管生成关系密切。 方法：采用回顾性研究1998-1999年行根治性放疗的食管癌病人，临床和病理资料完整的共110例，其中男性67例，女性43例。最小年龄43岁，最大年龄80岁，中位年龄66岁。病理类型全部选择为鳞癌。其放疗前的食管镜活检标本的存档蜡块，制成切片，应用免疫组织化学的方法检测肿瘤组织中survivin和VEGF基因蛋白的表达情况。 结果：1)食管癌病人中survivin蛋白染色阳性物质主要定位于胞浆和/或胞核，呈棕褐色或浅褐色。食管癌病人中survivin蛋白的表达率为78.2％，镜下癌旁组织中的表达率22.5％，差异有显著性(P＜0.001)，正常食管粘膜对照20例，全部为阴性。2)Survivin蛋白的表达与肿瘤组织的分化程度呈负相关关系，即survivin的表达水平越高，肿瘤的分化越差(x2=4.68；P=0.03)。3)Survivin和VEGF表达水平呈显著的正相关关系，相关系数r=.179，P=0.03。4)Survivin的表达水平与局部控制率表现出负相关趋势，但未达到统计学意义x2=3.24；P=0.07。与远处转移的有无未显示出相关关系x2=2.68，p=0.10。5)Survivin蛋白的表达不能预测总生存期：x2=1.33；P=0.248,。VEGF表达水平与总生存期(OS)呈显著相关性，强阳性组与阴性加弱阳性组差别显著(x2=4.04，P=0.04)，强阳性组的生存期显著缩短。 结论：Survivin蛋白在食管癌组织中表达率较高。与癌旁组织及正常组织比较，均显示了很高的表达率，提示survivin在食管癌发生发挥的作用。食管癌中survivin的表达水平与肿瘤组织分化程度有显著的负相关关系，表达水平越高，分化越差。食管癌中survivin的表达水平与肿瘤的局部控制率呈负相关趋势，提示survivin与放疗疗效有关。VEGF是食管癌放射治疗的预后因子，survivin与其有显著的正相关关系，提示survivin有可能通过参与血管生成机制而发挥放射抗拒作用。