背景和目的：胃癌是一种常见的恶性肿瘤。近年来,随着生活方式的转变和诊疗水平的提高,其全球发病率和死亡率虽较前已有所下降,但仍是第4位常见的恶性肿瘤,男、女性死亡率分别占癌症相关死亡的第3位和第5位,且大部分的新发病例都集中在我国等发展中国家。目前只有早期患者才可望通过手术治愈,而大多数病例确诊时已处晚期,治疗方法有限、预后不佳。为此,明确胃癌发生、发展机制,探索胃癌早期诊断及基因治疗新方法有重要意义。PTEN是1997年发现的一种抑癌基因,其编码的蛋白质具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性,通过调控PI3K/Akt等信号通路在细胞增殖与凋亡、迁移与粘附和遗传稳定等方面发挥重要作用。目前发现,由于基因突变、杂合性缺失、启动子甲基化和microRNA调控等遗传或表观遗传改变,胃癌中常存在PTEN失活。此外,PTEN的活性亦受到磷酸化调节,其磷酸化后将失去磷酸酶活性,但稳定性增加,进而失去抑癌功能,使肿瘤易感性增加。目前认为胃癌的发生通常经历“正常胃黏膜→慢性非萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌”这一过程,Hp感染常在其中起始发和先导作用。而在胃黏膜癌变过程中,PTEN磷酸化状态如何变化?PTEN磷酸化失活后是否可以通过影响Akt等下游靶因子,进而引起细胞生物学功能异常?Hp感染在其中作用又如何?因此,针对这些未知,本课题通过体内外研究探讨胃黏膜癌变过程中PTEN磷酸化状态的变化及其与Hp感染的关系,将为胃癌早期诊断及基因治疗提供新思路,并进一步阐明Hp致癌的可能机制。材料和方法：1.收集15例胃癌及癌远端组织、4株胃癌细胞株(MKN28、MKN45、 SGC-7901、AGS)及1株永生化正常胃黏膜上皮细胞株(GES-1),行Western blot检测PTEN、p-PTEN的表达。2.收集Hp阳性和阴性的慢性非萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生和胃癌病理标本(每组40例,其中Hp阳性和阴性各20例,共160例),行免疫组化检测PTEN、p-PTEN的表达。3. ATCC43504Hp标准菌株感染蒙古沙鼠建立Hp感染动物模型,同时以布氏肉汤灌胃的蒙古沙鼠作为对照组,收集末次灌胃6月和12月后胃黏膜标本,行免疫组化检测PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达。4. ATCC43504Hp标准菌株以MOI=50作用GES-1,同时以同体积细胞培养液作用的GES-1作为对照组,0、0.5、1、3、6、12h后,行Western blot检测PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达。5.PI3K抑制剂LY29400240μM预处理GES-11h,同时以同体积DMSO作用和未预处理的GES-1作为对照组,再以ATCC43504Hp标准菌株MOI=50作用1h,行Western blot检测PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达。6.Akt抑制剂Akt iⅧ10μM预处理GES-11h,同时以同体积DMSO作用和未预处理的GES-1作为对照组,再以ATCC43504Hp标准菌株MOI=50作用1h,行Western blot检测PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达。7. ATCC43504Hp标准菌株以MOI=5、10、50、100作用GES-10、0.5、1、3、6、12h后,行MTT检测细胞存活率；ATCC43504Hp标准菌株以MOI=50作用高表达各目的基因的胃黏膜细胞0、0.5、1、3、6、12h后,行MTT检测细胞存活率；ATCC43504Hp标准菌株以MOI=50作用Akt iⅧ10μM预处理1h后GES-10、0.5、1、3、6、12h,行MTT检测细胞存活率。结果：1.人胃癌组织和胃癌细胞株中PTEN的磷酸化状态(1)以癌远端组织中PTEN、p-PTEN表达水平为自身对照,13例(13/15,86.7%)胃癌组织中PTEN表达水平低于癌远端组织(p<0.001),10例(10/15,66.7%)胃癌组织中p-PTEN表达水平低于癌远端组织(p>0.05)。(2)将p-PTEN表达水平与PTEN表达水平相比,作为PTEN磷酸化比率,以癌远端组织中PTEN磷酸化比率为自身对照,10例(10/15,66.7%)胃癌组织中PTEN磷酸化比率高于癌远端组织(p<0.05)。(3)以GES-1细胞株中PTEN、p-PTEN表达水平为对照,MKN28、MKN45、 SGC-7901、AGS细胞株中PTEN表达倍数分别为3.43±0.41(p<0.001)、3.45±0.25(p<0.01)、3.25±0.39(p<0.01)、2.22±0.21(p<0.01), p-PTEN表达倍数分别为4.60±0.36(p<0.01)、19.5±1.39(p<0.001)、18.9±1.68(p<0.01)、7.96±0.32(p<0.001)。(4)将p-PTEN表达水平与PTEN表达水平相比,作为PTEN磷酸化比率,以GES-1细胞株中PTEN磷酸化比率为对照,MKN28、MKN45、SGC-7901、AGS细胞株中PTEN磷酸化比率倍数分别为1.35±0.17(p>0.05)、5.66±0.58(p<0.01)、5.84±0.50(p<0.01)、3.60±0.31(p<0.01)。2.人胃黏膜癌变过程中PTEN磷酸化状态的变化及其与Hp感染的关系(1) PTEN表达水平在慢性非萎缩性胃炎组最高,后随胃黏膜病变的演化而降低,在胃癌组表达最低,各病变阶段间表达有显著性差异(p<0.001)。将所有标本按Hp阳性和阴性分两组,Hp阳性组和阴性组各病变阶段PTEN表达亦呈现出类似结果(p<0.001、p<0.05)。(2) p-PTEN表达水平在慢性非萎缩性胃炎组最低,后随胃黏膜病变的演化而升高,在肠上皮化生组表达最高,在异型增生组和胃癌组均有较高水平表达,各病变阶段间表达有显著性差异(p<0.001)。将所有标本按Hp阳性和阴性分两组,Hp阴性组各病变阶段p-PTEN表达亦呈现出类似结果(p<0.001),而Hp阳性组各病变阶段p-PTEN均有较高水平表达,各病变阶段间表达无显著性差异(p>0.05)。(3)PTEN表达在各病变阶段Hp阳性和阴性组间均无显著性差异(p>0.05),p-PTEN表达在肠上皮化生、异型增生和胃癌阶段Hp阳性和阴性组间亦无显著性差异(p>0.05),而在慢性非萎缩性胃炎阶段Hp阳性组p-PTEN表达显著高于Hp阴性组(p<0.05)。3.Hp感染对蒙古沙鼠胃黏膜PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响(1)实验组、对照组中6月和12月两亚组间PTEN表达水平均无明显差异(p>0.05)。按不同实验时间点分为6月和12月两组,6月和12月两组中Hp感染与未感染亚组间PTEN表达水平亦无明显差异(p>0.05)。(2)实验组、对照组中12月亚组p-PTEN表达水平均显著高于6月亚组(p<0.001)。按不同实验时间点分为6月和12月两组,6月组中Hp感染与未感染亚组间p-PTEN表达水平无明显差异(p>0.05),而12月组中Hp感染亚组p-PTEN表达水平显著高于未感染亚组(p<0.001)。(3)实验组、对照组中12月亚组PI3K表达水平均显著高于6月亚组(p<0.01)。按不同实验时间点分为6月和12月两组,6月和12月两组中Hp感染与未感染亚组间PI3K表达水平则无明显差异(p>0.05)。(4)实验组、对照组中12月亚组Akt表达水平均显著高于6月亚组(p<0.001)。按不同实验时间点分为6月和12月两组,6月和12月两组中Hp感染与未感染亚组间Akt表达水平则无明显差异(p=0.05、p>0.05)。(5)实验组、对照组中12月亚组p-Akt (Ser473)表达水平均显著高于6月亚组(p<0.05)。按不同实验时间点分为6月和12月两组,6月和12月两组中Hp感染亚组p-Akt (Ser473)表达水平均显著高于未感染亚组(p<0.05)。(6)实验组、对照组中12月亚组p-Akt (Thr308)表达水平均显著高于6月亚组(p<0.05)。按不同实验时间点分为6月和12月两组,6月和12月两组中Hp感染亚组p-Akt (Thr308)表达水平均显著高于未感染亚组(p<0.05)。(7)实验组中12月亚组Bad表达水平显著高于6月亚组(p<0.05),而对照组中12月亚组Bad表达水平与6月亚组无明显差异(p>0.05)。按不同实验时间点分为6月和12月两组,6月、12月组中Hp感染亚组Bad表达水平与未感染亚组均无明显差异(p>0.05)。(8)对照组中12月亚组p-Bad表达水平显著高于6月亚组(p<0.01),而实验组中12月亚组p-Bad表达水平与6月亚组无明显差异(p>0.05)。按不同实验时间点分为6月和12月两组,6月组中Hp感染亚组p-Bad表达水平显著高于未感染亚组(p<0.05),而12月组中Hp感染亚组p-Bad表达水平与未感染亚组无明显差异(p>0.05)。(9)实验组、对照组中12月亚组GSK3β表达水平与6月亚组均无明显差异(p>0.05)。按不同实验时间点分为6月和12月两组,6月、12月组中Hp感染亚组GSK3β表达水平与未感染亚组均无明显差异(p>0.05)。(10)实验组中12月亚组p-GSK3β表达水平显著高于6月亚组(p<0.05),而对照组中12月亚组p-GSK3β表达水平与6月亚组无明显差异(p>0.05)。按不同实验时间点分为6月和12月两组,6月、12月组中Hp感染亚组p-GSK3β表达水平与未感染亚组均无明显差异(p>0.05)。4.Hp活菌对胃黏膜上皮细胞株PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响(1)Hp活菌以MOI=50作用GES-1不同时间后,PTEN表达水平无明显变化(p>0.05),而p-PTEN表达水平在作用后0.5h即升高,1h达到高峰,12h内均高于0h(p<0.001)。而对照组PTEN.p-PTEN表达水平均无明显变化(p>0.05)。(2)Hp活菌以MOI=50作用GES-1不同时间后,Ak、Bad、GSK3β表达水平均无明显变化(p>0.05),而p-Akt (Ser473)、p-Akt (Thr308)表达水平在作用后0.5h即升高,3h达到高峰,12h内均高于0h(p<0.001)；p-Bad、p-GSK3β表达水平在作用后0.5h即增加,后逐渐升高,12h达到高峰(p<0.001)。而对照组Akt、p-Akt (Ser473)、p-Akt (Thr308)、Bad、p-Bad、GSK3β、p-GSK3β表达水平均无明显变化(p>0.05)。5.PI3K在Hp活菌激活胃黏膜上皮细胞株PTEN/PI3K/Akt信号通路中的作用(1)Hp活菌以MOI=50作用GES-1不同时间后,PI3K表达水平无明显变化(p>0.05),对照组PI3K表达水平亦无明显变化(p>0.05)。(2)LY294002以40μM预处理GES-11h后,p-Akt (Ser473)(p<0.001)、 p-Akt (Thr308)(p<0.001)、p-Bad (p<0.001)、p-GSK3β(p<0.01)表达降低,而PTEN、p-PTEN、PI3K、Akt、Bad、GSK3β表达无明显变化(p>0.05); DMSO预处理GES-11h后PTEN、p-PTEN、PI3K、Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、 Bad、p-Bad、GSK3β、p-GSK3β表达则均无明显变化(p>0.05)。对照组、DMSO组、LY294002组中Hp作用亚组均以Hp活菌按MOI=50作用1h后,各组间PTEN,PI3K、Akt、Bad、GSK3β表达均无明显变化(p>0.05)。对照组、DMSO组、LY294002组中Hp作用亚组p-PTEN (p<0.05、p<0.001、 p<0.01)、p-Akt(Ser473)(p<0.001、p<0.01、p<0.01)、p-Akt (Thr308)(p<0.001、 p<0.01、p<<0.01)、p-Bad (p<0.05、p<0.05、p<0.01)、p-GSK3β(p<0.05、p<0.05、 p<0.05)表达水平均显著高于各自组中Hp未作用亚组。6.Akt在Hp活菌激活胃黏膜上皮细胞株PTEN/PI3K/Akt信号通路中的作用Akt iⅧ以10μM预处理GES-11h后,p-Akt (Ser473)(p<0.001)、p-Akt (Thr308)(p<0.001)、p-Bad (p<0.001)、p-GSK3β(p<0.01)表达降低,而PTEN、 p-PTEN、PI3K、Akt、Bad、GSK3β表达无明显变化(p>0.05)；DMSO预处理GES-11h后PTEN、p-PTEN、PI3K、Akt、p-Akt (Ser473)、p-Akt (Thr308)、 Bad、p-Bad、GSK3β、p-GSK3β表达则均无明显变化(p>0.05)。对照组、DMSO组、Akt iⅧ组中Hp作用亚组均以Hp活菌按MOI=50作用1h后,各组间PTEN、PI3K、Akt、Bad、GSK3P表达均无明显变化(p>0.05)。对照组、DMSO组中Hp作用亚组p-PTEN (p<0.01、p<0.01)、p-Akt (Ser473)(p<0.05、p<0.01)、p-Akt (Thr308)(p<0.05、p<0.01)、p-Bad (p<0.05、p<0.05)、 p-GSK3β (p<0.01、p<0.05)表达水平均显著高于各自组中的Hp未作用亚组；Akt iVIII组中Hp作用亚组p-PTEN表达水平显著高于组中Hp未作用亚组(p<0.01),而p-Akt (Ser473)、p-Akt (Thr308)、p-Bad、p-GSK3β表达水平则与组中Hp未作用亚组无明显差异(p>0.05)。7. PTEN/PI3K/Akt信号通路在Hp活菌影响胃黏膜上皮细胞株生长中的作用(1)Hp活菌以不同浓度作用GES-1不同时间后MTT显示,Hp活菌按MOI=5、10作用12h内,GES-1细胞存活率均无明显变化(p>0.05)；而按MOI=50、100作用6h后,GES-1细胞存活率均开始升高,12h达高峰(p<0.001),作用6、12h细胞存活率显著高于0.5、1、3h(p<0.001),作用12h细胞存活率显著高于6h(p<0.001)。(2)Hp活菌以MOI=50作用GES-1、GES-1-Empty、GES-1-PTEN-WT、 GES-1-PTEN-MT不同时间后MTT显示,在作用GES-1、GES-1-Empty、 GES-1-PTEN-WT6h后,细胞存活率均开始升高,12h达高峰(p<0.001),作用6、12h细胞存活率显著高于0.5、1、3h(p<0.001),作用12h细胞存活率显著高于6h(p<0.01)；而在作用GES-1-PTEN-MT12h内,细胞存活率则无明显变化(p>0.05)。(3)Hp活菌以MOI=50作用DSMO、Akt iⅧ预处理的GES-1不同时间后MTT显示,在作用无预处理、DSMO预处理的GES-16h后,细胞存活率均开始升高,12h达高峰(p<0.001),作用6、12h细胞存活率显著高于0.5、1、3h(p<0.001),作用12h细胞存活率显著高于6h(p<0.01)；而在作用Akt iⅧ预处理的GES-112h内,细胞存活率则无明显变化(p>0.05)。结论：1.PTEN表达下降和磷酸化失活参与了胃黏膜癌变过程,PTEN磷酸化失活是胃癌中PTEN失活的一种新机制。2.Hp感染早期即可诱导PTEN磷酸化失活,进而激活PI3K/Akt信号通路,促进胃黏膜细胞存活。