禽呼肠孤病毒(avian reovirus, ARV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus),是禽类重要的病原体。病毒基因组是由10个节段的双链RNA组成,可分为大(L)、中(M)、小(S)3组,主要编码10种结构蛋白和4种非结构蛋白。其中,p17蛋白是由ARV S1基因第二个开放阅读框编码的非结构蛋白,包含146个氨基酸,大小约为17 kD。由先前的研究可知,p17是细胞核-细胞质穿梭蛋白,其C端有核输入信号。而p17在核质中的分配与细胞的转录活性有关,且出核并不依赖于CRM1蛋白。p17可以通过PTEN、AMPK和PKR/eIF2a信号通路正调控细胞自噬,并增强病毒的复制。在调控细胞周期和宿主细胞翻译方面,p17蛋白可以通过激活p53通路来阻碍细胞的生长。因此,p17蛋白是一种多功能病毒蛋白,它在调控细胞自噬、细胞周期以及蛋白翻译方面都起着重要的作用。尽管如此,目前对p17蛋白功能的研究仍然还存在许多未知的地方。本研究通过鉴定p17蛋白的核输入信号与核输出信号,并突变p17蛋白核输入信号相关的功能氨基酸位点后,探究p17蛋白的细胞定位对其诱导的细胞自噬的影响以及对病毒复制的影响。1.禽呼肠孤病毒p17蛋白核输入信号与核输出信号的鉴定本研究首先将p17蛋白基因插入真核表达载体pEGFP-C1中,在宿主细胞中表达融合蛋白GFP-p17,建立了绿色荧光蛋白标记的细胞定位的方法。所得结果也与文献报道中的p17蛋白定位一致,也于ARV感染后的间接免疫荧光实验一致,说明本方法可以用于p17蛋白定位的研究。同时,选取转染pEGFP-p17后的不同时间点(9h、18 h、24 h、36h、48 h),观察p17蛋白在细胞中的分布情况。此外,也与p10、σNS另两个S基因组编码的非结构蛋白的定位进行了比较,结果也与p17蛋白在细胞中的定位不同。为鉴定p17的核输入信号,参考文献中报道的序列,并将该序列中以及周围存在的几个连续的碱性氨基酸进行突变,观察p17突变体的细胞定位情况。发现突变p17蛋白C端的第122和123位的氨基酸后,可使p17蛋白的核定位发生改变,观察到大部分荧光进入细胞质中,从而确定这两个氨基酸在p17蛋白的核定位中发挥着重要的作用。此外,p17是核质穿梭蛋白,目前的研究仅知道p17蛋白可以出核,且出核途径是CRM1蛋白非依赖的。本研究通过软件预测与序列比对,在p17蛋白的序列中找到多个疑似核输出信号的序列。将这些序列插入pEGFP-C1中进行表达鉴定,根据观察融合蛋白的表达情况后发现,在p17蛋白的N端第19-26位有一段氨基酸片段能使细胞核中大量的GFP进入细胞质,并认为它能够介导p17蛋白的出核,且这种出核可能是通过CRM1以外的其他途径。2.禽呼肠孤病毒p17蛋白核输入信号的突变调节细胞自噬与病毒的复制已有研究证实,p17可以诱导细胞产生自噬,但是对于p17调控细胞自噬的分子机制尚有待进一步的研究。本研究探讨了p17核输入信号对其引起细胞自噬及病毒复制的影响。为了研究p17蛋白的核定位与诱导细胞自噬的关系,构建了突变p17第122位和第123位的氨基酸的重组真核表达载体。在Vero细胞和DF1细胞中,表达p17核输入信号突变体短时间内的自噬水平均显著低于表达野生型p17的细胞。通过进一步检测p17入核对病毒增殖的影响,转染野生型p17再感染ARV后的病毒复制水平显著升高,说明p17可促进细胞自噬的同时促进病毒复制。而在感染病毒一定时间内,转染细胞p17入核信号突变体并不能明显的促进病毒的复制水平,与转染野生型p17的结果差异显著。