Rap1GAP缺失表达对卵巢癌恶性生物行为的影响

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目的:阐明卵巢癌组织/细胞中Rap1GAP差异表达程度及可能机理;探讨Rap1GAP蛋白对卵巢癌细胞恶性生物行为的影响及其可能机制。方法:1.通过GST-Pull down及Western blotting检测不同组织类型卵巢癌组织中Rap1GAP、C3G、Rap1-GTP的蛋白表达水平;2.RT-PCR及Western blotting检测了卵巢癌组织和卵巢癌细胞株中Rap1GAP的表达情况;3.通过慢病毒转染技术干扰及外源转染Rap1GAP的表达,筛选并建立稳定的目的细胞株;4.观察沉默原本呈高表达Rap1GAP的OVCAR3细胞株和外源转染原本呈低表达Rap1GAP的Hey细胞株生物行为的改变及其可能机制:MTT实验和平板克隆实验观察细胞增殖,Transwell实验观察细胞的恶性侵袭能力,免疫荧光观察细胞的形态变化,去甲基化处理及RT-PCR观察Rap1GAP表达的恢复情况,Western blotting检测Rap1GAP可能影响的信号通路相关蛋白表达水平。结果:1.GST-Pull down实验观察到,与正常组织和良性卵巢肿瘤相比,Rap-GTP表达升高的卵巢癌组织中,Rap1GAP和C3G均参与调节Rap酶的活性;2.RT-PCR及免疫印迹观察到,与自身正常组织相比,癌灶中Rap1GAP的表达降低始于转录阶段;3.通过慢病毒转染,成功筛选出低表达Rap1GAP的OVCAR3细胞和高表达Rap1GAP的Hey细胞;4.通过功能学实验观察到,敲低Rap1GAP后,OVCAR3细胞的增殖、侵袭能力均增强,HEY细胞过表达Rap1GAP后细胞增殖、侵袭能力减弱,并且观察到细胞形态改变,即F-actin在胞膜边缘聚集增加板状伪足和片状伪足增加。5.机制的探讨中发现,在高Rap1GAP表达的卵巢癌细胞OVCAR3中敲低RapGAP,会引起Wnt通路中关键蛋白GSK3βser9、β-catenin、c-myc、cyclinDl的表达上升,与此一致的是,在低Rap1GAP表达的细胞HEY中外源强制表达Rap1GAP,上述经典Wnt信号通路相关蛋白表达降低;6.去甲基化处理多个卵巢癌细胞株可以引起Rap1GAPmRNA的表达升高。结论:我们的研究提示,启动子甲基化可能是卵巢癌Rap1GAP缺失表达的原因;Rap1GAP可能通过抑制Rap1-GTP水解而保持酶活性从而促进肿瘤的侵袭,同时可能抑制Wnt通路促进细胞恶性增殖。
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