目的:吗啡(Morphine,Mor),作为极其重要的阿片类毒品,因具有很强的镇痛作用在临床长期使用,但是吗啡使用后会产生强烈的欣快感,进而造成吗啡依赖,并出现精神、认知功能障碍,行为不受自主控制等。海马(Hippocampus,Hip)作为中枢神经系统中的一个重要脑区,参与多种神经系统疾病的发生发展过程。以海马为研究对象探索毒品成瘾和损伤机制是重要的手段。研究发现,慢性吗啡处理造成大鼠海马神经元树突棘萎缩、消失,导致海马区δ阿片受体细胞重新分布,并减少δ阿片受体细胞的密度,这可能是改变海马生理功能,造成长时间认知障碍的重要原因。细胞凋亡(Apoptosis)是以细胞DNA发生特异性的降解,形态上表现为核固缩、胞膜发泡和凋亡小体形成为特征,是由特定的基因调控,无明显细胞溶解的过程。目前普遍认为细胞凋亡的通路有三种:线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路,其中前两者是经典的凋亡通路,后者是近些年发现的一种凋亡通路。线粒体膜电位的降低是细胞发生凋亡早期的重要标志,TUNEL法则能反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一,而caspase-3在凋亡信号传导的许多途径中发挥重要的功能。通过上述指标的检测,可以反映细胞发生凋亡的情况。大量研究表明,长期吗啡作用可造成神经系统损伤,且因吗啡摄入方式、剂量、时间和脑区不同而产生不同程度的损伤。Bajic等在给出生1天的大鼠连续注射6天半吗啡后,通过检测caspase-3水平发现,皮层和杏仁核有明显的神经元凋亡。本科室以往对吗啡诱导的依赖、损伤及机制进行了系列研究。谷建平等采取放射免疫分析法对吗啡依赖大鼠各脑区环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)含量进行测定,发现纹状体、间脑、中脑、脑桥和海马内cAMP含量明显升高,而(cGMP)含量明显下降,这表明cAMP和cGMP信号系统变化在吗啡依赖中起着重要作用。另有研究发现,大鼠在给予吗啡后,脑桥谷氨酸(Glu)含量明显升高,而中脑、海马、间脑和纹状体则未见明显变化,脑桥、中脑、间脑和纹状体γ-氨基丁酸(GABA)含量明显升高。史为博等发现,经过吗啡长期处理,大鼠中脑腹侧背盖区和黑质多巴胺能神经细胞出现变性坏死,表明吗啡产生毒性作用。此外,采用MTT法检测到吗啡能够剂量依赖性地降低SH-SY5Y细胞和PC12细胞的生存率,并检测到半数抑制率分别为2520μmol/L和680μmol/L,镜下观察到细胞突触变短或消失,细胞原有形态丧失。基于上述研究背景,本实验在成功培养大鼠原代海马神经元后,进行神经元鉴定,并通过MTT法确定合适的吗啡浓度,以及采取TUNEL法、流式细胞术法、线粒体膜电位检测(JC-1)法、蛋白免疫印迹法等方法,观察慢性吗啡作用诱导的大鼠原代海马神经元凋亡情况,以及对神经元凋亡的产生机制进行分析。方法:1本实验取材于新生24h以内的SD乳鼠,进行大鼠原代海马神经元培养。2采用免疫荧光法进行神经元鉴定,并用激光共聚焦显微镜观察细胞形态。3采用MTT法检测吗啡与大鼠原代海马神经元生存率之间时效和量效关系,为后续实验选择合适的吗啡浓度。4采用TUNEL法观察吗啡作用下大鼠原代海马神经元的变化,并计算各组凋亡率。5采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双标染色法检测各组细胞凋亡率。6采用线粒体膜电位检测方法,观察吗啡作用下原代海马神经元线粒体膜电位变化情况。7采用蛋白免疫印迹法检测Bax、caspase-3蛋白表达水平。以上所得数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析,用均数±标准差(mean±SD)表示,各组均数行单因素方差分析(one-way ANOVA),以Tamhane’s T2作两两比较,以p<0.05有统计学意义。结果:1大鼠原代海马神经元培养结果成熟的原代海马神经元,突触伸长且较粗并出现分支,交织成网,胞体呈锥形、椭圆形或三角形且丰满,周围光圈明显,少数神经元出现聚团生长现象。2免疫荧光法进行神经元鉴定结果采用免疫荧光法对培养成熟的原代海马神经元进行鉴定,以微管相关蛋白2(MAP2)为一抗,Tritc标记的二抗染色,DAPI复染,激光共聚焦显微镜下观察到神经元核为蓝色且体积较大,突触为红色且交织成网状,立体感强。3MTT法检测细胞生长抑制率结果相较于对照组,Mor(0.156mM~1.25mM)作用于大鼠原代海马神经元6h、12h、24h、48h后,神经元生长抑制率无明显变化,光镜下观察神经元形态亦无明显变化;相较于对照组,Mor(2.5mM~10mM)作用于大鼠原代海马神经元24h、48h时,Mor5mM作用于大鼠原代海马神经元12h时,Mor10mM作用于大鼠原代海马神经元6h、12h时,神经元生长抑制率明显升高,且随吗啡浓度升高而愈加升高,并呈时间依赖性,光镜下可观察到神经元空泡样结构甚至破裂,突触变短或消失,神经元形态丧失。4TUNEL法检测细胞凋亡率结果与对照组相比,1mM、2mM、3mM吗啡作用于大鼠原代海马神经元48h后,神经元凋亡率明显升高,且呈浓度依赖性,并且可以观察到TUNEL阳性数目随着吗啡浓度的升高而升高。5流式细胞术Annexin V-FITC/PI双标染色法检测细胞凋亡结果相较于对照组,Mor1mM、Mor2mM、Mor3mM组神经元总凋亡率明显升高,且以早期凋亡增加为主,并呈浓度依赖性。6线粒体膜电位检测(JC-1)法结果与对照组相比,Mor1mM、Mor2mM、Mor3mM组红色荧光强度随浓度升高而逐渐下降,绿色荧光强度随浓度升高而逐渐增加,表明线粒体膜电位下降,发生早期凋亡。7Western Blot检测Bax、caspase-3的表达结果与对照组相比,Mor1mM、Mor2mM、Mor3mM组原代海马神经元Bax、caspase-3蛋白表达水平明显升高,且呈浓度依赖性,提示神经元凋亡与Bax、caspase-3蛋白表达水平升高有关。结论:1、低浓度的吗啡可促进大鼠原代海马神经元的生长,而高浓度的吗啡则抑制大鼠原代海马神经元的生长。2、高浓度的吗啡作用可使培养的大鼠原代海马神经元发生变性坏死和凋亡,Bax表达增加和caspase-3的活化可能是引起的大鼠原代海马神经元凋亡的分子机制之一。