一、研究背景随着人类平均寿命的延长以及世界范围内人口老龄化,骨关节炎的发病率逐年增高,已成为家庭和社会的巨大负担：对骨关节炎的发病机制及防治研究,直是医学界的一个热点。骨关节炎的具体发病机制尚未完全阐明,目前认为是由多种因素相互作用而形成的。治疗骨关节炎的目标就是解除患者疼痛,改善关节功能,从而提高其生活质量。预防保健是最简便而且有效的方法；其它治疗手段如口服药物、关节腔注射等,主要缓解患者的疼痛从而部分恢复关节的功能,病情易反复,也容易产生一定的副作用,增加消化系统、心血管系统疾病的风险；目前公认较为彻底的治疗方法就是人工关节置换,但其费用昂贵、有一定的使用年限且存在一定的手术风险,并不适合我国国情。臭氧能够用于治疗疼痛,且止痛效果较传统的激素+局麻药的效果好,副作用远远小于类固醇激素,所以国内外逐渐将臭氧应用于骨关节炎的治疗。在缓解疼痛方面,取得了较好的效果。但在臭氧治疗骨关节炎的研究上,基础研究远远落后于临床实践,这极大的制约了骨关节炎臭氧疗法的应用及推广。目前臭氧疗法的相关研究集中于臭氧在血液中的作用及机制,尚未涉及臭氧作用于关节时对软骨、滑膜细胞的影响。血液中有强大的缓冲系统,也有各种抗氧化物质,臭氧氧化损伤的可能性较小；而关节腔中本来就是低氧环境,软骨细胞没有直接的血液供应,因此,直接把臭氧在血液中的作用及其机制直接生搬硬套过来,显然是不科学的。而且国内外使用臭氧治疗骨关节炎,各家使用臭氧的浓度、剂量、周期及频率各不相同。臭氧作为一种强氧化物质,使用过量必然会造成组织结构的损伤。那么,臭氧在骨关节炎中的作用究竟如何?临床治疗的时候,应该使用怎样的臭氧浓度?其治疗的频率、频次应该多少,才能既取得良好效果,又能最大程度避免其副作用呢?二、研究目的1.研究不同浓度臭氧对兔膝骨关节炎中软骨及滑膜的影响及其规律。2.研究不同浓度臭氧对兔膝骨关节炎作用的机制：通过研究不同浓度臭氧对炎性介质IL-1、TNF-α及MMP-13的影响,来确定其作用途径和机制；并探讨使用何种浓度的臭氧更适合于兔膝骨关节炎的治疗。3.研究不同次数臭氧注射对兔膝骨关节炎中软骨及滑膜的影响,观察不同次数的臭氧对炎性介质IL-1、TNF-α及MMP-13的影响及其规律。4.研究不同次数臭氧注射对兔正常膝关节中软骨及滑膜的影响,并观察其对炎性介质IL-1、TNF-α及MMP-13的影响,探讨臭氧注射是否具有累积效应。5.结合IL-1β及NF-κB抑制剂,研究臭氧对软骨细胞培养的影响及其机制。6.提出臭氧治疗兔膝骨关节炎的治疗方案,为制定临床骨关节炎臭氧疗法的标准化治疗方案提供更多科学依据。三、研究方法（一）不同浓度臭氧对兔膝骨关节炎的影响1.动物模型建立：为了不干扰兔膝关节的内环境,使用关节外造模的方法,即兔膝关节屈曲位管形石膏固定术固定6周,来建立兔膝关节骨关节炎模型。2.臭氧浓度的确定：临床上常用的臭氧浓度最高一般不超过60μg/ml,通常为20μg/ml-40μg/ml。本实验所用臭氧发生器为德国赫美斯臭氧治疗仪（Germany Humares公司）,其能产生的最大臭氧浓度为55μg/ml,因此,实验中将臭氧浓度设为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml及50μg/ml的等差浓度,以求能更精确的显示各个浓度等级的臭氧对关节组织结构的影响。3.动物分组：根据所使用臭氧浓度的不同,将实验动物分为正常组、模型组、纯氧组及5个臭氧组：臭氧10μg/ml组、臭氧20μg/ml组、臭氧30μg/ml组、臭氧40μg/ml组及臭氧50μ/ml组。正常组不予任何干预,模型组仅造模不予其它干预,纯氧组造模后在膝关节腔中注入医用纯氧2ml,5个臭氧组造模后分别在膝关节腔中注入相应浓度的臭氧2ml,所有注射频率均为1次／周,共3次。4.病理切片检查及Mankin评分：软骨标本经过脱钙、石蜡包埋、切片、HE染色后制作成病理切片,根据Mankin评分标准对软骨表面结构、细胞数量、细胞克隆及基质染色4个指标进行评分,每个指标均为0-3分,总分为各个指标得分相加。总分0分为正常,12分最高,分数越高损伤越严重。滑膜标本经过石蜡包埋、切片、HE染色后制作成病理切片,观察滑膜组织是否完整、有无增生、是否有炎性细胞浸入、是否有细胞凋亡或坏死等,评价不同浓度臭氧对滑膜的影响。5.软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-a及MMP-13的检测使用酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）法。已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。分别将IL-1、TNF-a及MMP-13和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中IL-1 TNF-a及MMP-13的浓度呈比例关系,用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。6.数据统计分析：数据统计使用SPSS13.0软件,软骨Mankin评分结果为有序分类变量,使用多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验,从总体上分析8组之间有无差别。经Kruskal-Wallis H检验后,如果8组之间差别有统计学意义则进行组间多重比较的Nemenyi检验。IL-1、TNF-α及MMP-13的检测结果应用one-way ANOVA进行分析,多组均数多重比较方差齐性时采用Student-Newman-Keuls （SNK）法,方差不齐时采用Dunnett T3法。不同臭氧浓度与IL-1、TNF-α及MMP-13表达之间的相关关系采用Spearman相关分析。检验水准为a=0.05,P<₀.05表示差异有统计学意义或有显著性差异。结果以均数±标准差（x±s）表示。（二）不同次数臭氧注射对兔膝骨关节炎的影响1.动物模型的建立：新西兰大白兔仅右侧膝关节进行骨关节炎造模,动物模型建立的方法同上所述。2.臭氧浓度的确定：前述实验的结果提示臭氧作用于兔膝骨关节炎的最佳浓度为20μg/ml,所以本实验部分使用的臭氧浓度为20μg/ml。3.动物分组：根据臭氧注射次数的不同分为4组：0次组、1次组、3次组、5次组,分别接受0次（即仅穿刺不进行臭氧注射）、1次、3次及5次臭氧注射。臭氧注射的浓度为20μg/ml,进行多次注射时,注射间隔为1周。4.病理切片检查及Mankin评分：同前所述,制作成切片后从表面结构、细胞数量、细胞克隆及基质染色4个方面进行Mankin评分,0分为正常,12分最高,分数越高软骨损伤越严重。5.软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-a及MMP-13的检测：同前所述,采用组织匀浆后进行ELISA法检测。6.数据统计分析：数据统计使用SPSS13.0软件,软骨Mankin评分结果为有序分类变量,使用多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验,从总体上分析4组之间有无差别。经Kruskal-Wallis H检验后,如果4组之间差别有统计学意义则进行组间多重比较的Nemenyi检验。IL-1、TNF-α及MMP-13的检测结果应用one-way ANOVA进行分析,多组均数多重比较方差齐性时采用Student-Newman-Keuls （SNK）法,方差不齐时采用Dunnett T3法。不同臭氧注射次数与IL-1、TNF-α及MMP-13表达之间的相关关系采用Spearman相关分析。检验水准为a=0.05,P≤0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异。结果以均数±标准差G±s)表示。（三）不同次数臭氧对兔正常膝关节的影响1.动物模型的建立：本实验部分选用兔正常膝关节,不需要造模。2.臭氧浓度的确定：本实验部分使用的臭氧浓度为20μg/ml。3.动物分组：根据臭氧注射次数的不同分为4组：0次组、1次组、3次组、5次组,分别接受0次（即仅穿刺不进行臭氧注射）、1次、3次及5次臭氧注射。臭氧注射的浓度为20μg/ml,进行多次注射时,注射间隔为1周。4.病理切片检查及Mankin评分：同前所述,制作成切片后从表面结构、细胞数量、细胞克隆及基质染色4个方面进行Mankin评分,0分为正常,12分最高,分数越高软骨损伤越严重。5.软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-a及MMP-13的检测：同前所述,采用组织匀浆后进行ELISA法检测。6.数据统计分析：数据统计使用SPSS13.0软件,软骨Mankin评分结果为有序分类变量,使用多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验,从总体上分析4组之间有无差别。经Kruskal-Wallis H检验后,如果4组之间差别有统计学意义则进行组间多重比较的Nemenyi检验。IL-1、TNF-a及MMP-13的检测结果应用one-way ANOVA进行分析,多组均数多重比较方差齐性时采用Student-Newman-Keuls （SNK）法,方差不齐时采用Dunnett T3法。不同臭氧注射次数与IL-1、TNF-a及MMP-13表达之间的相关关系采用Spearman相关分析。检验水准为a=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异。结果以均数±标准差G±s)表示。（四）臭氧对兔软骨细胞培养的影响1.软骨细胞的取材、分离及培养取体重2-2.5kg的新西兰大白兔（雌雄不限）,耳缘静脉注射空气处死,常规备皮、消毒、铺巾,无菌条件下剪开皮肤,咬骨钳取出关节,无菌手术刀片削取厚度约0.1～0.2mm的软骨,放入盛有PBS液的培养皿中,剪碎,移入25ml培养瓶中,用PBS液清洗软骨块两次,去除残余血迹,加入0.1%Ⅱ型胶原酶2ml消化20分钟,轻轻吹打后弃去上清,并重复1次；再加入0.1%Ⅱ型胶原酶5ml,37℃下震荡消化6-8小时,1500r/min离心3分钟使细胞沉淀,弃消化液后清,用培养液清洗三次,以洗去细胞表面的消化酶；重悬成细胞混悬液。无菌200目滤网过滤细胞混悬液后,计数。按5×105/孔的密度将细胞混悬液接种于6孔板中,培养液选用低糖DMEM、20%胎牛血清、1%（v/v）双抗、0.69mM抗坏血酸及2mM左旋谷氨酰胺,缓冲液选用HEPES。将6孔板置于PCO25%的孵箱中培养72小时。显微镜下显示大部分细胞贴壁牢固并且生长成亚融合状态后,给予干预。2.实验分组：试验分成A-F六组：其中A表示空白对照组（normal）,B代表NF-κB抑制剂组（NF-I）, C表示臭氧组（03）,D表示IL-1β组（IL）,E表示IL-1β+NF-κB抑制剂组（IL+NF-I）, F表示IL-1β+臭氧组（IL+03）。每组样本量为5个。根据预实验的结果,使用臭氧浓度为20μg/ml,加入臭氧的量为0.5ml,即每个培养孔加入的臭氧剂量为10μg。NF-κB抑制剂的浓度稀释为100μg/ml,每孔加入100gL,即10μg/孔。IL-1β的浓度为100ng/ml,每孔加入100μL,即10ng/孔3.干预及不同时间点培养液的获取将6孔培养板置于PC025%的孵箱中培养72小时。显微镜下显示大部分细胞贴壁牢固并且生长成亚融合状态后,准备给予干预。首先弃6孔培养板中原有培养液,并在每个孔中添加1000μL新培养液,在B组、E组对应培养孔中添加浓度为100μg/ml的NF-κB抑制剂1001μL,在D组、E组、F组对应培养孔中添加浓度为100ng/m的IL-1β100μL;随后将每个培养孔中培养液的总量添加至2000μL；接着在C组、F组对应孔中注射浓度为20μg/ml的臭氧0.5ml,从获取臭氧到注射之间的间隔控制在15s以内,整个注射的过程不少于lmin,且注射器针头始终处于相应培养孔培养液的下方。所有干预完成后,在5分钟内每个孔取500μL的培养液,置于冻存管中-20℃保存；24h后每个孔再取500μL的培养液,同样置于冻存管中-20℃保存；48h后,将个孔剩余培养液置于冻存管中-20℃保存。同时更换新培养液,不再予以其它干预,软骨细胞待检测。4.观察内容和检测指标检测0h、24h、48h三个不同时间点各组上清液中T-SOD、MDA、NO、iNOS的含量,采用免疫组化方法观察各组软骨细胞NF-κB、COX-2的表达,WesternBlot检测软骨细胞NF-κB的表达,流式检测各组软骨细胞的凋亡情况。5.统计学处理结果用SPSS 13.0统计软件,培养液T-SOD、MDA、iNOS、NO不同时间点的检测使用重复测量方差分析,其它数据采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,若经Levene检验,数据满足方差齐性,用SNK法对各组数据进行多重比较；数据不满足方差齐性,则采用方差分析的近似方法Dunnett T3法进行统计分析,结果用：x±s表示,p<0.05表示有显著性差异。四、研究结果1.不同浓度的臭氧对软骨的作用各异,浓度与效应有相关性在实验中可观察到,不同浓度的臭氧可加重或减轻兔膝骨关节炎中软骨的损伤。软骨损伤程度的判断通常使用Mankin评分,0分为正常,分数越高损伤越严重。各组软骨细胞的Mankin评分由高到低分别为：臭氧50μg/ml组（7.8分）>模型组（6.8分）及纯氧组（6.8分）>臭氧40μg/ml组（5.4分）>臭氧30μg/ml组（4.6分）>臭氧10μg/ml组（4.4分）>臭氧20μg/ml组（3.4分）>正常组（0.2分）。提示臭氧浓度从10μg/ml到20μg/ml升高的过程中,减轻骨关节炎软骨细胞损伤的能力增强,而在20μg/ml到50μg/ml的范围内,随着臭氧浓度的增高,软骨细胞的损伤程度加重,到达50μg/ml时,其损伤程度高于模型组,这个时候不仅不能起到治疗的作用,反而加重关节软骨的损伤。2.臭氧对滑膜增生有明显的抑制作用且具有浓度-效应相关性在注射臭氧的组别中,兔膝关节滑膜的数量远远少于模型组及纯氧组,也少于正常组；并且随臭氧浓度的增加,滑膜减少越来越明显。提示臭氧能够抑制滑膜的增生,臭氧的浓度越高,其抑制作用越强。光镜下,模型组及纯氧组的滑膜组织增生明显,正常组滑膜细胞数量、排列正常,而臭氧各组随着浓度的增加,滑膜细胞增生程度逐渐减少,滑膜组织完整性逐渐丧失,到40μg/ml及以上浓度时,滑膜细胞数量较正常明显减少,外层滑膜结构完整性丧失。提示越高浓度的臭氧,对滑膜组织的氧化损伤程度越重。3.软骨、滑膜组织中三种炎性介质表达的变化臭氧注射进关节腔以后,能引起软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-α及MMP-13这三种炎性介质表达程度的改变,且其变化趋势较一致,在软骨及滑膜组织中表达情况也较一致,由高到低均为：臭氧50μg/ml组>纯氧组和模型组>臭氧40μg/ml组>臭氧10μg/ml组和臭氧30μg/ml组>臭氧50μg/ml组>正常组。臭氧浓度在40μg/ml的范围内,三种炎性介质在软骨和滑膜中的表达均呈“U”形分布,在20μg/ml以上时,随着浓度的增高,三种炎性介质的表达均明显升高,达到50μg/ml时,其表达超过模型组及纯氧组（50μg/ml组与模型组及纯氧组之间两两比较均为P=0.000）。提示浓度为50μg/ml的臭氧可明显加重关节组织的损伤。这与软骨、滑膜光镜下的表现一致。4.不同次数臭氧对兔膝骨关节炎软骨及滑膜的影响各异为了观察臭氧的注射次数会对关节造成何种影响,进行了不同次数臭氧对兔膝骨关节炎软骨、滑膜作用的研究。实验结果显示,不同次数的臭氧注射后,对软骨组织的影响各异,Mankin评分由高到低分别为0次组（6.75分）和5次组（6.75分）>1次组（4.63分）>3次组（3.38分）,但1次组和3次组之间比较无显著性差异（P=0.32）。提示注射臭氧可一定程度上减轻软骨组织的损伤,但注射次数大于等于5次时,可能无法起到治疗的作用,甚至会加重软骨组织的损伤。随着臭氧注射次数的增加,滑膜组织的数量越来越少,5次组的滑膜数量明显减少以致获取有一定的难度。软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-α及MMP-13这三种炎性介质表达程度的变化趋势较一致,在软骨及滑膜组织中表达情况也较一致,由高到低均为：0次组>5次组>1次组>3次组。提示注射臭氧的次数在3次或以内时,可在一定程度上减轻兔膝骨关节炎的损伤,而当注射的次数达到或超过5次时,可能不仅得不到治疗效果,反而造成关节损伤程度的加重。5.不同次数臭氧对兔正常膝关节软骨及滑膜造成影响且存在次数-效应相关性为了比较不同次数臭氧关节腔注射的安全性,评价两次臭氧注射间隔设定为1周的合理性,观察不同次数臭氧注射对兔正常膝关节软骨、滑膜的影响,实验结果显示,不同次数的臭氧注射后,对软骨组织的影响各异,Mankin评分由高到低分别为5次组（3.75分）和3次组（2.38分）>1次组（1.38分）>0次组（0.13分）。提示注射20μg/ml的臭氧会对正常膝关节中的软骨组织造成一定的损伤,且随着注射次数的增加,损伤程度逐渐加重。随着臭氧注射次数的增加,滑膜组织的数量越来越少,5次组的滑膜数量明显减少以致获取有一定的难度。软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-α及MMP-13这三种炎性介质在软骨及滑膜组织中表达的趋势一致,均随着注射臭氧次数的增多而增高。提示在正常关节腔中注射浓度为20μg/ml的臭氧,会对软骨、滑膜组织造成一定的损伤,且该损伤具有一定的累积效应,在注射间隔为1周时,注射的次数越多,造成的损伤越严重。6.臭氧对软骨细胞的培养有影响在IL-1p存在的情况下, NF-κB抑制剂及臭氧均能抑制NF-κB的表达, NF-κB抑制剂的抑制作用明显强于臭氧；臭氧可以明显减少由IL-1β引起的软骨细胞凋亡及坏死；臭氧可以提高软骨细胞培养液中T-SOD的含量、降低MDA的水平,也能在一定程度上降低iNOS及NO的水平。五、结论1.较低浓度的臭氧可能可以延缓骨关节炎病程的进展,而较高浓度的臭氧能加重关节的损伤。不同浓度臭氧在同样进行3次关节腔内注射时,20μg/ml的臭氧效果最佳。2.不同次数臭氧对兔膝骨关节炎软骨及滑膜的影响各异,注射臭氧的次数在3次时,能最大程度减轻兔膝骨关节炎的损伤,而当注射的次数达到5次时,反而加重关节损伤的程度。在使用臭氧治疗骨关节炎时,要注意臭氧注射的总次数,必要时适当降低臭氧注射的频次,以避免加重关节的损伤。3.臭氧注射进兔正常膝关节时,会造成一定程度的软骨、滑膜组织损伤,随着臭氧注射次数的增加,损伤加重。臭氧注射进关节腔后会在短时间内有一定的累积效应,使用臭氧治疗骨关节炎时应适当延长两次治疗间的间隔时间。4.在IL-1β存在的情况下,臭氧能轻度抑制NF-κB的表达,可以明显减少由IL-1β引起的软骨细胞凋亡及坏死,可以提高软骨细胞培养液中T-SOD的含量、降低MDA的水平,也能在一定程度上降低iNOS及NO的水平。5.利用臭氧关节腔注射的方法治疗骨关节炎时,应该遵循“低浓度、少频次、长间隔”的原则。