论文部分内容阅读
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是引发结核病的主要病原菌,据统计世界上约三分之一的人口感染,使得结核病成为单一病原菌感染导致的首要致死因素,甚至超过了艾滋病。目前结核菌耐药性的出现已成为全球面临的普遍难题,尤其是多重耐药、广泛耐药,甚至全耐药结核分枝杆菌的产生为结核病的治疗提出了巨大挑战。因此对耐药性结核分枝杆菌产生的机理研究将会对结核病的干预策略提供重要理论支持。细菌耐药性的产生有多种机制,比如药物靶点的突变、细菌产生破坏药物结构的灭活酶、细菌生物膜的形成、细胞膜或细胞壁通透性的改变、主动外排机制等。其中主动外排机制通过高表达药物外排蛋白实现对菌体内抗生素的外排,主要包括5大家族:ATP结合盒家族(ATP binding cassette,ABC)、主要易化子超家族(major facilitator superfamily,MFS)、耐受小节分裂区家族(resistance nodulation cell division,RND)、小耐多药性家族(small multidrug resistance family,SMR)和多药及毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family,MATE)。其中ABC、MFS、SMR、RND家族已经证实在结核分枝杆菌中均存在。ABC家族转运蛋白主要以ATP为能量进行底物的转运,而其它家族转运蛋白主要依赖于跨膜质子动力势。MFS家族是最大的次级转运蛋白家族,其蛋白结构以典型的MFS fold为特征,可进行不同底物的转运,比如药物、有机阳离子和阴离子、糖等等。本课题主要以MFS超家族转运蛋白Rv0191为研究对象,用生物信息学预测发现Rv0191在分枝杆菌属中非常保守,并且预测其可能是一种氯霉素外排蛋白。为了进一步验证Rv0191的功能,我们在耻垢分枝杆菌中敲除了Rv0191同源基因Ms0232,并且用结核分枝杆菌Rv0191进行回补。通过比较抗生素敏感性分析,我们发现与预测相吻合的是ΔMs0232对氯霉素更加敏感,且回补菌株能够恢复表型。药物外排泵基因在相应抗生素压力下通常会上调表达来介导抗生素耐药,因此我们用RT-PCR方法检测了耻垢分枝杆菌Ms0232在氯霉素处理后的转录水平变化,发现Ms0232在氯霉素压力下明显上调表达。同时我们通过启动子活性测定发现Rv0191启动子在氯霉素处理后活性显著增强,表明Rv0191可以参与氯霉素响应。结核分枝杆菌中存在庞大且复杂的信号转导及转录调控网络,我们通过生物信息学预测工具筛选了Rv0191预测的上游调控因子Rv1353c,构建的Rv1353c重组耻垢分枝杆菌对氯霉素敏感,并且通过EMSA实验和RT-PCR验证了Rv1353c蛋白可以直接负调控Rv0191。综上所述,我们揭示了结核分枝杆菌MFS超家族转运蛋白Rv0191参与氯霉素耐受及其上游调控机制,为结核分枝杆菌耐药性机理提供了新思路。