目的:棉花(Gossypium hirsutum)是世界上重要的经济作物,也是天然纤维的主要来源。黄萎病(Verticillium Wilt)是棉花的主要病害,严重影响了棉花的产量和品质,制约了棉花的生产。黄萎病是一种土壤传播的维管束病害,可以危害两百多种双子叶植物,包括重要的经济作物棉花,番茄和生菜等。在我国,黄萎病是棉花的主要病害;其主要致病菌大丽轮枝菌是一种土壤传播的、半活体营养的丝状真菌,主要定殖在植物的木质部,由于其休眠形式的微菌核可以在土壤中存活数十年,因此人们一直没有找到防治黄萎病的有效措施。近年来,研究人员通过基因组、转录组、蛋白质组、T-DNA突变体库和基因敲除等手段对大丽轮枝菌致病相关基因进行了广泛的研究,取得了阶段性进展,特别是在大丽轮枝菌侵染结构的研究方面取得了重要进展。大丽轮枝菌基因组编码七百多种分泌蛋白,但人们对分泌蛋白的研究还不是很深入,分泌蛋白的分泌过程也不清楚。目前仅少数几个被鉴定与病原菌的致病性相关。由于分泌蛋白的多样性,导致研究较为困难,但是分泌途径相关的组分相对保守,通过对分泌途径相关组分的研究,将为棉花黄萎病的防治提供一个新的靶点。胞吐作用是真核生物细胞内基于囊泡运输的传统分泌途径,此外还存在一些非传统的分泌途径。真菌生长所需的营养物质和致病相关的因子等通过囊泡运输的方式被转运到细胞质膜的特定位置行使功能。囊泡依赖于马达分子肌球蛋白Myosin V(Myo V)提供动力和能量沿微丝提供的细胞轨道进行运输。Myosin V在丝状真菌中相对保守,在模式真菌酵母和构巢曲霉中已经得到了很好的研究,但是在大丽轮枝菌中还没有被研究。本研究对大丽轮枝菌中V型Myosin在病原菌致病过程中的功能进行了研究,以此希望能为棉花黄萎病的防治提供一个新的理论依据。方法:(1)根据已报导的模式丝状真菌构巢曲霉中的V型Myosin蛋白序列在大丽轮枝菌的数据库中进行同源序列比对,找到了大丽轮枝菌中同源的V型肌球蛋白Myosin2(Myo2),并构建了丝状真菌中V型肌球蛋白的系统进化树。(2)利用农杆菌介导的同源重组方法获得了大丽轮枝菌Myo2的单一敲除突变体菌株△Vdmyo2,并对其菌落形态、萌发速率及菌丝生长习性等进行观察。(3)构建Myo2-GFP融合表达载体,转化△Vdmyo2菌株获得了回复菌株△Vdmyo2/Vd Myo2-GFP。通过转盘式激光共聚焦显微镜观察了大丽轮枝菌菌丝生长过程中Myo2的时空动态模式。(4)利用扫描电子显微镜观察了大丽轮枝菌的入侵过程。(5)利用注射法和蘸根法侵染了大丽轮枝菌的宿主,棉花和拟南芥,比较分析了突变体菌株和对照野生型菌株的致病力差异。(6)利用超速离心浓缩的方法收集了大丽轮枝菌(突变体和野生型对照)的分泌蛋白,进行蛋白i TARQ质谱实验,利用Scaffold 4.0软件进行差异蛋白筛选,利用Blast2GO软件进行差异蛋白功能注释,差异蛋白GO分析,差异蛋白功能分类以及差异蛋白的表达分析,阐述了肌球蛋白Myo2动力系统介导的大丽轮枝菌的致病机理。结果与结论:(1)大丽轮枝菌中V型肌球蛋白Myo2与其他丝状真菌的同源性相对较高,在丝状真菌中功能相对保守。敲除突变体菌株表现出严重的生长缺陷,白色菌丝明显减少,黑色素增多,微菌核增加,菌落生长速率减慢。同时也严重影响了分生孢子的形态和菌丝的极性。分生孢子呈圆形,菌丝失去了极性呈三维立体式生长,菌丝变粗,分支和分隔明显增加,上述结果表明Myo2参与了分生孢子的发育和菌丝的极性生长过程。(2)大丽轮枝菌Myo2-GFP在胞质中呈点状体,在菌丝顶端的顶体处呈圆形体,且与顶体的Marker FM4-64共定位,该结果进一步显示大丽轮枝菌的Myo2在囊泡运输过程发挥重要作用。(3)宿主棉花和拟南芥接种实验显示突变体菌株的致病力显著下降。接种突变体菌株的棉花茎的维管束感病程度较轻,并且在茎切断中也不能分离出病原菌,表明Myo2对大丽轮枝菌的致病力是必需的。通过拟南芥的入侵实验说明突变体菌株仍然能侵入宿主细胞,推测致病下降的原因可能不是由侵染过程受阻导致的,主要的原因可能是Myo2缺失后在分泌蛋白外泌过程中囊泡运输上发生了功能缺陷。(4)通过分泌蛋白的蛋白质组数据我们发现Myo2缺失后大丽轮枝菌分泌蛋白的能力在同等条件下降低了。参与碳水化合物的转运和修饰以及细胞内转运、分泌、囊泡转运过程蛋白均存在显著差异。因此认为Myo2作为蛋白分泌途径中的重要组分,通过调节大丽轮枝菌致病相关的分泌蛋白的分泌来影响大丽轮枝菌的致病性,在大丽轮枝菌与宿主植物互作的过程中发挥重要的作用。