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C1orf109是课题组前期获得的一个功能未知基因,定位于h Ch1p34.3。NCBI数据库数据显示C1orf109有多个转录本,可编码多个存在长度和/或序列差异的蛋白质。课题组前期发现C1orf109短转录本编码203个氨基酸的蛋白参与肿瘤细胞的细胞周期调控,影响细胞的迁移运动。但截至目前,C1orf109更加深入的功能却未见报道。本研究的目的在于揭示C1orf109长编码转录本（C1orf109L）的生物学功能,探究C1orf109L影响肿瘤细胞增殖的分子探讨C1orf109L可否作为肿瘤治疗的潜在靶点。研究首先分析和确定C1orf109的两个较长转录本编码蛋白的亚细胞定位差异,并利用制备的C1orf109单克隆抗体,采用外源过表达C1orf109的细胞株,证实所制备的C1orf109抗体可以特异性识别该基因的不同翻译产物。在此基础上,应用免疫印迹技术检测C1orf109在多种肿瘤细胞以及永生化细胞（HEK-293）中表达量。进而结合大数据分析显示C1orf109在肿瘤细胞内存在表观遗传修饰,进一步采用DNA甲基化酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理细胞,通过免疫印迹和实时定量PCR技术检测C1orf109表达量,发现细胞内源性C1orf109L表达上调,初步证实组蛋白乙酰化的表观遗传修饰参与了C1orf109L的表达调控。鉴于C1orf109L的表达特征,研究进一步分析了C1orf109L对多种细胞增殖的影响。结果表明,C1orf109L表达可以抑制多种肿瘤细胞的增殖活力。通过在He La以及HEK-293细胞中构建C1orf109L的Tet-on稳定转染细胞系,探究C1orf109L对细胞增殖能力的影响,结果证实C1orf109L可以显著抑制细胞体外增殖,同时裸鼠移植瘤实验进一步证明C1orf109L可以抑制小鼠的移植瘤生长。为深入分析这一作用的临床意义,研究通过Gene Expression Profiling Interactive Analysis分析了C1orf109对直肠腺癌以及肾透明细胞癌病人的生存与预后影响,结果显示二者存在显著的正相关。为阐释C1orf109L抑制瘤细胞增殖的分子基础,研究分析了C1orf109L对细胞周期的影响,结果表明C1orf109L可以阻碍细胞周期由G1期向S期转化,并且阻滞细胞周期于G2期。进而通过转录组数据分析发现,C1orf109L调控了多个细胞周期调控相关基因以及DNA损伤相关基因的表达,尤其影响了细胞周期检测点的调控蛋白表达。应用LC-MS/MS分析C1orf109L的相互作用蛋白,并通过Gene Ontology注释结合免疫印迹分析RNAse A处理后的细胞染色质中C1orf109L水平,结果显示C1orf109L可能在RNA的加工过程中发挥作用。进一步利用生物信息技术解析C1orf109L相互作用蛋白的互作网络,研究筛选C1orf109L参与RNA加工过程的互作蛋白,发现RNA解旋酶DHX9与C1orf109L的互作,进而通过构建DHX9功能域的截短体,采用免疫沉淀证实C1orf109L与DHX9的酶活性区域以及C末端相互结合。为探究C1orf109L引起细胞周期阻滞的分子机制,本研究通过分析C1orf109L相互作用蛋白种类,发现其中有超过50%的蛋白参与R-loop调控,而R-loop是引起DNA损伤的一个重要因素。为此,在研究中分离R-loop并通过R-loop特异性抗体进行免疫沉淀,采用免疫印迹技术证实DHX9、PARP1以及C1orf109L蛋白均位于R-loop区域。为了确定C1orf109L对R-loop影响,研究应用免疫荧光技术以及DHX9和PARP1干扰实验证实C1orf109L可通过与PARP1竞争性结合DHX9促进R-loop积累,并且后者在I型拓扑异构酶抑制剂camptothecin（CPT）作用下增强。彗星电泳结果表明,C1orf109L表达可以触发DNA损伤,在CPT作用下DNA损伤加剧。通过检测DNA损伤标志物γH2AX发现,随着CPT处理时间的延长γH2AX增加。而且,C1orf109L表达后DNA损伤下游信号通路的关键分子p21上调,并且失活磷酸化CDK1增加,敲低p21可恢复C1orf109L引起的细胞增殖抑制。为了分析C1orf109L对I型拓扑异构酶抑制剂化疗敏感性的影响,研究通过Time-Lapse实验发现C1orf109L在CPT处理5 h左右就可引起细胞死亡,而且C1orf109L在CPT作用下激活细胞的死亡信号通路。此外,检测C1orf109L在细胞内的半衰期,并揭示了C1orf109L通过泛素化蛋白酶体途径降解,在CPT作用下C1orf109L主要以K48连接方式介导蛋白质降解。综上所述,本文通过对C1orf109L在多种癌细胞内表达分析以及对细胞增殖以及细胞周期影响的研究,表明其在调控肿瘤细胞周期以及抑制肿瘤细胞增殖中具有重要的生物学功能。基于C1orf109L促进R-loop积累引起DNA损伤并激活下游信号通路,以及可增强CPT敏感性,因此C1orf109L可作为一个潜在的肿瘤治疗靶点。