随着生殖医学的迅速发展,辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology, ART)在不孕症的治疗中已被广泛应用,但体外受精-胚胎移植技术(In Vitro Fertilization-Embryo Transplantation, IVF-ET)的疗效远未达到人们理想的期望值,在决定IVF-ET能否成功的众多因素中,卵巢储备功能占有重要地位。卵巢储备功能是指卵巢内存留的卵泡数量和质量,反映女性的生育潜能。在不孕症患者进行辅助生殖技术治疗过程中,卵巢内存留的卵泡数量的降低意味着促排卵治疗后获卵数低、可供移植胚胎数少,卵子质量下降会导致卵子受精率低、受精后胚胎发育不良、着床率低、流产率高,这些均会导致妊娠率降低。因此,研究和探索影响卵巢储备功能和卵巢反应性的机制对改善ART结局具有积极意义。淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)及其裂解产物包括sAPPα、 sAPPβ、Aβ40和Aβ42在阿尔茨海默病(Alzheimer Disease, AD)中已经被广泛研究,且被发现存在于猪卵巢的颗粒细胞和卵泡液中,但APP及其裂解产物包括sAPPα、sAPPβ、Aβ40和Aβ42在人卵巢中的表达和功能尚未有研究。研究表明,APP作为一种跨膜蛋白,涉及一系列的细胞活动,包括轴突的生长,神经细胞的增殖,细胞粘附和细胞迁移,APP的恰当表达对于认知功能的维持具有关键作用,在AD发生机制中APP高表达被认为与认知功能减退有关,此外,APP在神经系统表达量与雌孕激素含量存在一定相关性。APP有两种代谢途径并产生四种主要的裂解产物,一种是淀粉样代谢途径,产生sAPPβ、Aβ40和Aβ42,一种是非淀粉样代谢途径,产生sAPPα。虽然Aβ40和Aβ42低聚物被确认是AD病人中淀粉样斑块的主要组成成分,但Aβ40和Aβ42单体被认为具有神经营养和神经保护作用,在神经元发育和功能维持方面发挥重要作用。sAPPα的特点有：保护神经元免受损害,并且加强神经元从缺血损伤中的恢复,保护细胞免受兴奋毒性和氧化应激的损伤。sAPPβ特点有：提高神经祖细胞增殖和生存促使人类胚胎干细胞向神经快速分化。在本研究中,我们收集IVF取卵周期不孕患者的卵巢颗粒细胞标本及卵泡液标本,分析比较APP及其裂解产物包括sAPPα、sAPPβ、Aβ40和Aβ42表达水平与基础窦状卵泡数(Antral Follicle Count, AFC)、获卵数、临床妊娠率的相关性；体外培养大鼠颗粒细胞,在添加Aβ40或使APP过表达情况下检测卵泡刺激素受体(Follicle Stimulation Hormone Receptor, FSHR)、类胰岛素生长因子-1(Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1)、类胰岛素生长因子-1受体(Insulin-like Growth Factor-1 receptor, IGF-1R)、P450芳香化酶(P450 aromatase, P450 arom)、胆固醇侧链裂解酶(cholesterol Side-chain Cleavage Cytochromes P450, P450scc)、类固醇合成急性调节蛋白(Steroidogenic Acute Regulatory protein, StAR)的mRNA表达的变化,初步探索APP及其裂解产物sAPPα、sAPPβ、Aβ40、Aβ42与IVF/ICSI患者治疗结局的关系及其可能机制。第一部分：淀粉样前体蛋白及其裂解产物在人卵巢中的表达及其与卵巢储备和卵巢反应性的关系[研究目的]：探讨IVF-ET周期中,APP在IVF/ICSI患者卵巢颗粒细胞中的表达及sAPPα、 sAPPβ、Aβ42、Aβ40在卵泡液中的表达与卵巢储备、卵巢反应性是否相关。了解APP在人卵巢组织以及小鼠卵巢组织、子宫内膜、骨骼肌的表达情况。[研究方法]：1.选择2013年6月至2013年9月于南方医科大学南方医院生殖医学中心行IVF/ICSI治疗并且使用长方案的患者,排除多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、有卵巢手术史、严重男方因素性不育的患者。共纳入51例不孕患者。月经第3-5天检测阴道B超下AFC。所有患者于前一月经周期口服避孕药预处理,于黄体中期使用达菲林降调节,当垂体完全降调节后加用促性腺激素,当至少两个主导卵泡直径≥18mm时,肌注HCG,36小时后取卵,记录不孕患者的获卵数。2.用Ficoll梯度离心法分离拾卵后的所有卵泡液、获取颗粒细胞,采用Western blotting方法测定颗粒细胞APP的表达,并进行半定量分析。留取第一管无血上午卵泡液,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法测定取卵日卵泡液的sAPPα、sAPPβ、Aβ42,Aβ40水平。比较APP相对表达量、sAPPα、sAPPβ、Aβ42,Aβ40水平与AFC和获卵数的关系。如果数据服从双正态分布,用pearson相关分析,如果数据不服从双正态分布,采用spearman相关性分析。3.从病理科收集手术切除的人卵巢组织标本,采用免疫组织化学方法检测APP在人卵巢组织中的定位表达。同时采用疫组织化学方法比较APP在小鼠卵巢组织、骨骼肌、子宫内膜的定位表达情况。[研究结果]：1. Western blotting结果显示,APP表达于IVF/ICSI患者的卵巢颗粒细胞；ELISA结果显示,sAPPα、sAPPβ、Aβ42,Aβ40存在于IVF/ICSI患者的卵泡液中。2.不孕患者卵巢颗粒细胞的APP相对表达量与AFC之间存在显著负相关,相关系数为-0.448(P<0.05),IVF/ICSI患者卵巢颗粒细胞的APP相对表达量与获卵数之间也存在显著负相关,相关系数为-0.467(P<0.05)。不孕患者卵泡液中的sAPPα、sAPPβ、Aβ42,水平与AFC相关系数分别为-0.108,-0.269,-0.164,-0.089,但无统计学差异(P>0.05)。卵泡液中的sAPPα、sAPPβ、Aβ42,Aβ40Aβ40水平与获卵数相关系数分别为0.032,-0.129,0.098,-0.047,但无统计学差异(P>0.05)。3.免疫组织化学结果显示,APP在人卵巢组织的颗粒细胞、卵丘细胞及卵子呈阳性表达,APP在小鼠卵巢颗粒细胞和卵子、骨骼肌以及子宫内膜均呈阳性表达。[研究结论]：1.APP存在于不孕患者卵巢颗粒细胞,sAPPα、sAPPβ、Aβ42,存在于不孕患者卵泡液中。且APP与AFC、获卵数之间呈显著负相关,提示卵巢颗粒细胞APP表达与IVF/ICSI患者卵巢储备、卵巢反应性相关。2.不孕患者卵泡液中sAPPα、sAPPβ、Aβ42,Aβ40水平可能与AFC及获卵数无相关性。由于本研究所选标本较少,尚需扩大样本量进一步研究。3.APP在小鼠卵巢组织的颗粒细胞、卵子及子宫内膜阳性表达,提示APP可能与小鼠生育力相关。第二部分：淀粉样前体蛋白及其裂解产物与辅助生殖技术妊娠结局的关系[研究目的]：探讨IVF-ET周期中,APP在IVF/ICSI患者卵巢颗粒细胞中的表达及sAPPα sAPPβ、Aβ42,Aβ40在卵泡液中表达与IVF/ICSI妊娠结局是否相关。[研究方法]：1.选择2013年6月至2013年9月于南方医科大学南方医院生殖医学中心使用GnRHa长方案行IVF/ICSI-ET治疗的51例患者,排除多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、有卵巢手术史、严重男方因素性不育的患者。经拾卵后的所有卵泡穿刺液用Ficoll梯度离心法分离颗粒细胞,采用Western blotting方法测定颗粒细胞APP的表达,并进行半定量分析。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法测定取卵日卵泡液的sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40水平。记录两原核数、胚胎数、≤5%碎片的8细胞胚胎数、种植率、取消移植率、临床妊娠率等指标。2.数据分析时,首先将51例不孕患者按经IVF-ET治疗是否获得妊娠分为两组,临床妊娠组和非妊娠组,比较两组患者APP及其裂解产物sAPPα、sAPPβ、 Aβ42、Aβ40的表达水平是否有统计学差异。然后将51例不孕患者按照Aβ40浓度的百分位数将患者分为三组：<145.87pg/ml为低浓度组(n=12),145.87-270.98 pg/ml为中浓度组(n=27),>270.98 pg/ml为高浓度组(n=12)。比较三组间的两原核数、胚胎数、≤5%碎片的8细胞胚胎数、≤5%碎片的8细胞胚胎数占总胚胎个数的比例、种植率、取消移植率、临床妊娠率是否有统计学差异。3.连续变量进行正态分布性检验,结果用均数±标准差来表示。如果数据是正态分布的话,组间的比较采用t-test或者是One Way ANOVA。如果数据是非正态分布的话,组间的比较采用Wilcoxon Sign Rank test或者是Kruskal-Wallis test。采用SPSS16.0软件进行统计学分析,P<0.05为差异由统计学意义。[研究结果]1.妊娠组的Aβ40水平显著高于未妊娠组(228.60±53.21 pg/ml vs. 178.90±76.59 pg/ml, P<0.05)。但是两组的APP、sAPPα、sAPPβ、Aβ42水平无统计学差异(2.16±2.00 vs.1.38±1.13,0.236; 148.99±42.17ng/ml vs.157.50±57.50 ng/ml, P=0.627; 127.16±35.02 ng/ml vs.127.08±31.34 ng/ml, P=0.993; 58.31±75.33 pg/ml vs.47.51±19.59 pg/ml, P=0.511).2.Aβ40低、中、高浓度组的妊娠率分别为16.6%(2/12)、59.2%(16/27)、58.3%(7/12),Aβ40中、高浓度组的妊娠率显著高于低浓度组的妊娠率(P<0.05)；Aβ40低、中、高浓度组的取消移植率分别为9%(1/11)、0%(0/27)、9%(1/11),中浓度组的取消移植率显著低于低浓度和高浓度组的取消移植率(P<0.05)；Aβ40低、中、高浓度组的种植率分别为21%(4/19)、49%(25/51)、33%(8/24),Aβ40中浓度组的种植率最高,但无统计学差异(P>0.05)。3.三组间的两原核数、胚胎数、≤5%碎片的8细胞胚胎数、≤5%碎片的8细胞胚胎数占总胚胎个数的比例无统计学差异(P>0.05)。[研究结论]：卵泡液中恰当浓度的Aβ40水平可能对IVF临床结局有关,尚未发现APP、sAPPα、sAPPβ、Aβ42与IVF妊娠结局有相关性,由于临床样本数有限,需要扩大样本进一步研究。第三部分：Aβ40对体外培养大鼠颗粒细胞的增殖及甾体激素生成相关分子的影响[研究目的]：研究不同浓度Aβ40对大鼠颗粒细胞增殖及甾体激素生成过程相关分子表达的影响,以探索Aβ40可能通过何种途径影响卵子发育。[研究方法]：体外培养21日龄SD雌性大鼠的卵巢颗粒细胞,分别加入不同浓度(Opg/ml、 100 pg/ml、200 pg/ml、300 pg/ml、400 pg/ml)的Aβ40,作用细胞24小时。用CCK-8检测不同浓度组的颗粒细胞增殖状况。用RT-PCR的方法测定巢颗粒细胞中甾体激素生成相关分子FSHR、IGF-1、IGF-1R、P450 arom、P450scc、StAR的mRNA水平。[研究结果]：1.与对照组比较,200、300、400pg/ml浓度的Aβ40均能促进大鼠卵巢颗粒细胞增殖(P<0.05)。200 pg/ml Aβ40对颗粒细胞的促进增殖作用最强(增殖率114.53%),其次是300 pg/ml Aβ40(增殖率110.06%),100 pg/ml Aβ40和400 pg/mlAβ40对颗粒细胞的促进增殖作用最弱(增殖率分别为106.77%和106.86%)。2.与对照组(0pg/ml Aβ40)比较,200 pg/ml Aβ40和400 pg/mlAβ40对TSHR、 StAR、P450arom基因表达有促进作用(P<0.05);200pg/mlAβ40对IGF-1、P450scc基因表达有促进作用(P<0.05),但400 pg/mlAβ40对IGF-1、P450scc基因表达无促进作用(P>0.05); 400 pg/mlAβ40对IGF-1R基因表达有促进作用(P<0.05),但200 pg/mlAβ40对IGF-1R基因表达无促进作用(P>0.05)。[研究结论]1.Aβ40可能通过提高颗粒细胞的增殖能力从而改善了卵子质量、有助于获得临床妊娠。2.Aβ40可能通过提高颗粒细胞中FSHR、IGF-1、IGF-1R、P450 arom、 P450scc、StAR的基因表达从而改善了卵子质量、有助于获得临床妊娠。3.不同浓度的Aβ40对这些分子的调节作用不同。过高浓度的Aβ40可能对卵巢颗粒细胞有负面作用,提示只有适当浓度的Aβ40对颗粒细胞、卵子、妊娠是有利的。第四部分体外培养大鼠颗粒细胞中APP过表达对甾体激素生成相关分子的影响[研究目的]探讨APP过表达对卵巢颗粒细胞甾体激素生成过程相关分子的影响,以探索APP可能通过何种途径影响卵泡生长。[研究方法]21日龄SD雌性大鼠腹腔注射孕马血清50IU/只,48小时收集卵巢颗粒细胞进行原代培养。培养细胞分为3组：对照组：培养液中不加任何处理因素；空载组：培养液中加入空载质粒及转染试剂Lipo 2000; APP过表达组：培养液中加入APP真核表达质粒及转染试剂Lipo 2000。Western blotting方法检测APP蛋白表达变化,检测转染效率。APP过表达后,RT-PCR方法检测甾体激素生成相关分子FSHR、IGF-1、IGF-1R、P450arom、P450scc、StAR及凋亡分子Bax、Bcl2的mRNA表达变化。[研究结果]APP过表达后：IGF-1的基因表达明显受抑制(P<0.05),其mRNA水平降至约对照组的四分之一；P450arom和P450scc的基因表达明显增加(P<0.05),其mRNA水平上调至对照组的约15倍；StAR的基因表达明显增加(P<0.05),其mRNA水平上调至对照组的约7倍；IGF-1R和FSHR的基因表达明显增加(P<0.05),其mRNA水平约上调至对照组的约2倍；Bax、Bcl2的基因表达明显增加(P<0.05),其mRNA水平约上调至对照组的约2倍。[研究结论]APP过表达可能通过影响颗粒细胞细胞中甾体激素生成相关分子FSHR、 IGF-1、IGF-1R、P450arom、P450scc、StAR及凋亡Bax、Bcl2的基因表达影响卵泡生长。