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背景及目的胆汁淤积(cholestasis)是指胆汁不能从肝脏流回小肠,胆汁流量减少,肝脏胆汁酸和其他有毒化合物的过量积聚而导致的一种常见临床综合症。药物摄入、遗传性胆汁酸转运蛋白突变、先天性胆管闭锁、肝内外胆道梗阻、病毒感染、激素水平异常等因素均可诱发胆汁淤积。慢性胆汁淤积易导致肝损伤、炎症、肝纤维化、肝硬化、甚至肝功能衰竭,终末肝病期以肝脏移植为主要治疗手段,缺乏有效的药物治疗,严重影响患者生存和预后。肿瘤坏死因子受体超家族 12A(tumor necrosis factor receptor superfamily member 12A,TNFRSF12A),又名成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(fibroblast growth factor-inducible 14,Fn14),其主要的生理学功能是参与组织对急慢性损伤的应答反应。骨骼肌损伤、多发性硬化、缺血性心脏病、中风、肾小球疾病的急慢性组织损伤中TNFRSF12A呈高表达。新近的研究证实,TNFRSF12A在非酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝病、慢性丙型肝炎和肝细胞癌等慢性肝脏疾病的肝组织表达上调。然而,TNFRSF12A在胆汁淤积性肝损伤中的功能和分子机制尚不清楚。因此,本论文通过临床胆汁淤积肝组织样本分析、小鼠胆汁淤积模型以及体外胆汁酸摄取模型,探讨TNFRSF12A在胆汁淤积性肝脏中的表达、功能及其分子机制,为揭示胆汁淤积发病机理及治疗靶点提供依据。方法1.实时定量 PCR(Real time quantity PCR,RT-qPCR)法和免疫印迹(Western Blot,WB)法检测临床梗阻性胆汁淤积肝组织、胆道结扎小鼠肝组织和胆汁酸摄取的肝癌细胞PLC/PRF/5-ASBT细胞中TNFRSF12A mRNA和蛋白水平的表达。2.首先我们通过转录激活样效应因子核酸酶法(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)成功构建并鉴定了 Tnfrsf12a 基因敲除(Tnfrsf12a-KO)小鼠,其次对野生型(Wild-type,WT)小鼠和Tnfrsf12a基因敲除(Tnfrsf12a-KO)小鼠分别进行了胆道结扎(Bile duct ligation,BDL)手术和假手术(Sham operation)以构建胆汁淤积小鼠模型。最后处死小鼠并收集小鼠血清和肝组织,全自动生化仪分析小鼠血清肝脏生化指标,苏木精和伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色、实时定量PCR、免疫印迹和免疫组织化学检测小鼠胆汁淤积肝组织中TNFRSF12A表达缺失后的功能及关键信号分子表达,采用透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)进一步观察转基因小鼠及对照组小鼠的肝损伤形态学改变。3.采用胆汁酸摄取肝癌细胞PLC/PRF/5-ASBT细胞(肝癌细胞系PLC/PRF/5稳转 ASBT(Apical sodium-dependent bile acid transport)的细胞系)模型,通过改变TNFRSF12A的基因表达,初步分析TNFRSF12A参与调控胆汁淤积性肝损伤的分子机制。结果1.临床梗阻性胆汁淤积肝组织和胆道结扎小鼠肝组织中TNFRSF12A的mRNA和蛋白表达水平均显著上调。结合型胆汁酸诱导TNFRSF12A表达上调,且TNFRSF12A的表达量与胆汁酸处理时间呈依赖关系。2.对Tnfrsf12a-KO小鼠BDL后的功能研究表明,TNFRSF12A缺失可显著降低胆道结扎小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)的水平,TNFRSF12A缺失减轻胆道结扎小鼠肝损伤。肝脏组织学检测结果显示:WT组和Tnfrsf12a-KO组BDL小鼠肝组织的坏死和凋亡形态学无明显改变。进一步通过透射电子显微镜进行肝组织形态学研究证实,胆汁淤积可诱导肝细胞焦亡,且TNFRSF12A缺失减少胆道结扎小鼠肝细胞焦亡。3.在体外肝癌细胞PLC/PRF/5中的分子机制研究表明,在胆汁淤积条件下,TNFRSF12A通过激活NF-κB/GSDMD信号通路诱导肝细胞焦亡,加重胆汁淤积性肝损伤。结论在胆汁淤积条件下,肝脏TNFRSF12A表达上调,TNFRSF12A通过激活NF-κB/GSDMD信号通路诱导肝细胞焦亡,加重胆汁淤积性肝损伤。TNFRSF12A有望成为治疗胆汁淤积性肝损伤的分子靶点。