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本文以兴安落叶松木屑为原料,研究了兴安落叶松木屑中天然强力抗氧化剂紫杉叶素的提取分离工艺及其抗氧化机制,最终确立了一整套酶诱导—超声提取—大孔吸附树脂富集分离—正相柱层析分离纯化的紫杉叶素提取分离的工艺,并首次阐明了紫杉叶素抗氧化Nrf2机制,本研究为我国林业生物制剂的研究与开发提供了新思路。具体研究结果如下:1.建立了紫杉叶素定量分析方法色谱柱:HIQ sil C18V色谱柱5 μ(250 mm×4.6 mm I.D.),流动相:甲醇/水/乙酸(44:56:0.4,V/V/V),流速 1 mL/min,进样量 10 μL,柱温:35℃,检测波长:290 nm。在该检测条件下,紫杉叶素标准曲线R2为0.9994,精密度和重复性R.S.D.均小于3%,平均加样回收率为96.94%,R.S.D.小于2%。2.对兴安落叶松木屑中紫杉叶素的超声提取条件进行了优化,对影响紫杉叶素提取率的因素进行了考察,并确定了最佳工艺参数:提取方法:超声提取法提取溶剂及液固比:80%乙醇,20:1提取时间:2.5 h提取功率:250 W提取温度:60℃提取次数:3次在上述优化条件下,紫杉叶素提取率为1.25 mg/g,比未优化之前提高了 15.2%。3.通过考察酶诱导—超声提取不同的组合方式对兴安落叶松木屑中紫杉叶素提取率的影响,首次确定了高效率、低成本的酶诱导-超声波提取工艺:诱导方式:酶诱导—超声提取酶种类:纤维素酶+果胶酶酶比例:1:1每种酶浓度:0.5 mg/mL酶培养时间:18 h酶培养温度:30℃酶培养pH:5.0在上述优化条件下,纤维素酶和果胶酶复合诱导兴安落叶松木屑中紫杉叶素提取率为1.35 士 0.04 mg/g,经过复合酶诱导转化后紫杉叶素收率为127.36%。4.对大孔吸附树脂分离富集紫杉叶素进行了研究及优化,确定了 AB-8大孔吸附树脂富集分离紫杉叶素的最佳条件:上样浓度:30mg/mL上样体积:3mL上样流速:0.4 mL/min洗脱溶剂及体积:10%乙醇水溶液5BV;20%乙醇水溶液25BV洗脱流速:1 mL/min在上述优化条件下,经过大孔树脂柱层析富集后,紫杉叶素纯度由1.54%提高到43.31%,收率为 90.02%。5.对柱层析纯化紫杉叶素进行了研究,选择正相硅胶为填料,以氯仿—甲醇体系进行洗脱:样品硅胶质量比为1:15,洗脱剂为氯仿、氯仿:甲醇30:1、氯仿:甲醇25:1、氯仿:甲醇20:1,在氯仿:甲醇=20:1洗脱部分中得到紫杉叶素针状晶体,晶体中紫杉叶素的纯度为94.35%,收率为72.46%。6.抗氧化活性评估和细胞内抗氧化机制研究表明紫杉叶素具有很强的抗氧化能力,首次阐明了紫杉叶素在细胞氧化应激过程中激活Nrf2,继而由细胞质中转移入细胞核中参与细胞内抗氧化应激的调控。DPPH清除自由基实验与还原能力测定实验均表明紫杉叶素具有很好的抗氧化活性,IC50值分别为22.57±0.24和9.06±0.19 μM;通过DNA damage保护实验,表明紫杉叶素对PBR322质粒DNA有着明显的保护作用;通过检测HepG2细胞内黄嘌呤氧化酶(XOD)、总超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GR)的活性变化来评估其对氧化还原酶系的活性影响,紫杉叶素还能够有效的抑制黄嘌呤氧化酶的活性,在紫杉叶素浓度为30 μM时,其抑制率为59.13%,在一定程度上能够提高总谷胱甘肽的含量和总超氧化物歧化酶的活性,活性分别提高了 9.63 mg/prot和4.43 g/prot;通过Western blotting检测进一步检测相关蛋白的表达可以发现,核因子E2相关因子2(Nrf2)的核转移是通过PI3K/AKT、ERK和JNK信号通路的激活,Nrf2从细胞质转移到细胞核与核内元件ARE结合,从而激活了血红素氧化酶(HO-1)和醌氧化还原酶1(NQO1)的表达。本文对兴安落叶松木屑中高附加值的天然抗氧化剂紫杉叶素的提取分离工艺及其抗氧化机制进行了系统研究,为紫杉叶素产业化开发和相关产品研制提供了重要的科学依据和研究基础,为推动东北森林资源的精深加工提供了科学示范。