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中国是马铃薯最大生产国,马铃薯产业发展中存在的问题之一是淀粉加工用品种匮乏,其原因是功能基因资源发掘、鉴定和利用有限,从而阻碍了马铃薯产业的发展。马铃薯为四倍体无性繁殖作物,天然杂交/基因重组机会少,自然突变体极少。此外,马铃薯基因组测序工作才开始,尚未完成。虽然拟南芥(2n)和水稻(2n)等植物基因组测序已完成,基因组所载信息尚未完全明确,对其它植物基因功能的研究指导有限。
基因功能鉴定成为后基因组时期的重要任务之一,反向遗传学思想仍然是鉴定基因功能的重要思路。其中反义途径因其利用了目的基因的mRNA被其自身反义mRNA互补结合,从而达到抑制目的基因表达的目的,成为了鉴定真核生物功能基因的可靠途径。而农杆菌介导的转基因方法使反义结构体内表达成为可能。
本课题组在对马铃薯淀粉生物合成研究中,分离获得2431 bp的马铃薯基因组DNA片段,定名为NUI,多次不同时间在GenBank的原核和真核生物数据库检索,未发现与其同源的序列。鉴于马铃薯基因资源发掘有限制约了其育种研究等原因,本研究应用反义技术,将NUI以不同方向构建到植物表达载体pCambia1305.1中,转化马铃薯体内,CaMV35S启动子驱动NUI转录,实现对目的基因表达的抑制,获得目的基因敲除突变体,为明确NUI功能和获得目的基因奠定基础。
本研究获得以下结果:一、构建了CaMV35S启动子驱动的反义NUI植物转化载体pC-NUIa和正义NUI植物转化载体pC-NUIb。二、建立了高效农杆菌介导马铃薯基因转化方法,并将NUI以不同方向转化马铃薯体内,PCR检测表明,已经获得含目的DNA NUI的转基因马铃薯苗。三、初步确定NUI片段的序列方向,即以PCR扩增所用的上游引物端为NUI序列的5端。四、获得了生长矮小、叶片失绿的NUI表型突变体五株(nuI1-5),其它类型突变体有待进一步识别鉴定。