论文部分内容阅读
本研究通过对奶牛乳腺上皮细胞的培养方法的筛选，培养出生理功能正常的奶牛乳腺上皮细胞，以该细胞为模型，研究棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞生长、胞液脂质小滴的形成、脂肪酸合成及其相关酶基因表达的影响。从荷斯坦奶牛乳房无菌采取乳腺组织，通过不同的方法分离、培养、纯化奶牛乳腺上皮细胞，研究奶牛乳腺上皮细胞的体外培养效果。结果表明：组织块接种、0.25％的胰酶和100u／mL透明质酸酶的混合液37℃消化组织块3h，可以得到大量细胞用于原代培养。在以DMEM为基础培养液，在培养液中添加10％的胎牛血清、100ug／mL的双抗、表皮生长因子(10ng／mL)、胰岛素(0.5ug／mL)、氢化可的松(1ug／mL)、孕酮(1ug／mL)、转铁蛋白(5ug／mL)、谷氨酰胺(0.3mg／mL)等，组成的完全培养液中奶牛乳腺上皮细胞生长良好。显微结构显示：奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中含有不同的细胞类型，大多数上皮细胞呈多角形，细胞之间连接成片，细胞界限明显，部分细胞界限不明显。用Western-blotting检测奶牛乳腺上皮细胞分泌的β-酪蛋白，以鉴定该细胞的生理功能是否正常；通过染色体的数目及核型分析以鉴定体外培养的奶牛乳腺上皮细胞是否发生转化。结果显示：培养液中含有β-酪蛋白，说明该乳腺上皮细胞生理状况良好；染色体数目正常，染色体数目为60，核型与哺乳动物染色体图谱一致，说明该细胞系在体外培养条件下未发生转化。在奶牛乳腺上皮细胞培养液中添加游离脂肪酸，包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸，研究外源脂肪酸对乳腺上皮细胞生长、胞液中脂质小滴的形成、细胞脂肪酸合成以及脂肪酸合成关键酶ACC、FAS、FAT／CD36和SCDmRNA表达量的影响。结果显示，棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸对细胞的生长都有抑制作用，抑制作用随着脂肪酸的添加量和不饱和程度的增加而增加；油酸、亚油酸对胞液中脂质小滴的合成有促进作用，而棕榈酸、硬脂酸没有这种作用；棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸都能抑制细胞内脂肪酸的从头合成；棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸对ACC、SCDmRNA的表达有抑制作用，对FAS、FAT／CD36mRNA的表达有促进作用。