随着生物学进入后基因组时代，功能基因组学成为当代生命科学研究的重点与焦点。单核苷酸多态性(single nucletide polymorphism，SNPs)作为后基因组时代功能基因组学研究的主要内容之一，具有数量众多、分布广泛、易于批量检测等特点，在连锁分析与基因定位、疾病易感性、群体遗传学、药物基因组学与环境基因组学等方面具有重要应用价值。缺血性脑血管病(Ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是遗传因素和环境因素共同作用而导致的一种多基因遗传病，发病机制异常复杂。目前已知的危险因素有高血压、糖尿病、高龄、高脂血症、吸烟、肥胖、高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHcy)等等。这些因素导致ICVD的具体机制目前尚无完整的理论，但最终仍需通过遗传因素起作用。研究表明，基因组序列上的变异，即基因多态性(gene polymorphism)是决定人体对疾病易感性与抵抗性、疾病临床表型多样性以及人体对药物治疗反应差异性的重要因素。以生物学功能相关基因作为候选基因进行关联研究是当前缺血性脑血管病遗传易感性研究的主要策略。目前所研究的与ICVD相关的候选基因达几十种之多，大致分为以下几类：高血压相关基因、载脂蛋白基因、凝血因子相关基因、动脉粥样硬化相关基因和同型半胱氨酸代谢酶基因等，这些基因的产物被认为参与了ICVD病理发生的相关生物学途径。但是，这些结论大多来自欧美及日本人群，目前尚未见中国汉族群体的大规模研究报道。并且不同民族、不同地域SNP的分布以及遗传易感基因的频率迥然相异。为此，我们以SNP为遗传标记，采取“病例一对照”和传递／不平衡的研究策略，选取血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)基因、5—脂氧合酶激活蛋白基因(5—lipoxygenase activating protein，ALOX5AP)、亚甲基四氢叶酸还原酶基因(Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)、胱硫醚合成酶基因(Cystathioninep-synthase，CBS)以及蛋氨酸合成酶基因(Methionine synthase，MS)等5个候选基因进行河南汉族人群缺血性脑血管病SNP的分析和遗传易感性研究，旨在从遗传学角度探讨ICVD的病因及发病机制，为缺血性脑血管病的防治以及个体化预防和治疗提供理论依据。论文内容主要分3部分：第一部分ALOX5AP基因6个热点SNPs与缺血性脑血管病的关联研究方法：随机选取2004年12月至2005年7月河南省二甲以上医院神经内科住院的ICVD患者246例，ICVD的诊断参照第四届中华医学会关于缺血性脑血管病的诊断标准，其中脑血栓形成99例，脑梗塞82例，腔隙性脑梗塞37例，短暂性脑缺血发作28例。男145例，女101例，平均年龄59.98±15.22岁。对照组选取245例同期健康体检的随机个体，男124例，女121例，平均年龄56.08±15.62岁。以上两组均为无血缘关系的河南地区汉族个体，排除癫痫、癌症及肝肾功能不全者。所有受试者均签署知情同意书。采用SNaPshot多重微测序技术进行SNP分型。具体方法如下：提取基因组DNA，采用TD-PCR技术进行多重PCR扩增，用虾碱性磷酸酶(SAP)和外切酶Ⅰ(EXOⅠ)进行PCR产物纯化，进行SNaPshot延伸反应，最后加入甲酰胺9μl，0.25μl内标Liz120和纯化的微测序产物1μl，95℃变性5 min后迅速放在冰上淬火2 mins，在ABI的PRISM~R3730x1DNA测序仪上进行毛细管电泳，运行GeneMapper4.0软件分析实验结果。数据资料运用SPSS12.0统计软件进行统计分析，各组之间的基因型频率及等位基因频率的比较进行χ~2检验，以非条件Logisitic回归分析所得的相对风险度(Odds Ratio，OR)及95％可信区间(CI)估计基因突变对ICVD发生的相对危险度；Hardy-Weinberg平衡检验、单倍型频率计算、连锁不平衡分析采用SHEsis软件。用逐步Logisitic回归分析ICVD发生的危险因素。结果：单位点关联分析发现：ICVD组ALOX5AP基因SG13S114位点AA的基因型频率17.1％与A等位基因频率41.3％均显著高于对照组10.6％与32.7％，差异具有统计学意义(P＜0.05)。对阳性关联位点SG13S114进行性别、年龄分层分析，ICVD组AA基因型频率与A等位基因频率在男性群体及年龄小于50岁的人群中，均显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。相对风险分析发现，携带A等位基因的人发生ICVD的危险性增加，OR=1.350，95％CI为(1.041～1.751)。单倍型分析发现：ICVD组ALOX5AP基因的SG13S377G／SG13S114A／SG13S41A／SG13S35G单倍型频率显著高于对照组，P=0.006，OR=1.599，95％CI为(1.142～2.239)。而SG13S377T／SG13S11 4G／SG13S41G／SG13S35A单倍型频率显著低于对照组P=0.026，OR=0.745，95％CI为(0.576～0.965)。配对连锁不平衡分析在SG13S114和SG13S377、SG13S32和SG13S377之间检测到强连锁不平衡(D’＞0.8)。河南汉族人群SG13S35的基因频率与英国人群比较，有显著性差异(P＜0.05)。逐步Logistic回归分析显示SG13S114是ICVD发生的主要危险因素。第二部分：血管紧张素原基因多态性与缺血性脑血管病的相关性研究方法：研究对象与第一部分相同。采用PCR-RFLP的分型方法对AGT基因的A-20C、G-6A、T174M、M235T等4个SNPs位点进行基因分型。数据资料运用SPSS12.0软件进行统计分析，基因型频率及等位基因频率的比较、相对危险度估算、Hardy-Weinberg平衡检验、单倍型频率计算、连锁不平衡分析等均与第一部分相同。结果：单位点关联分析发现：AGT基因A-20C位点的AC基因型频率与C等位基因频率在ICVD组(26％，13.8％)与对照组(18.4％，9.6％)间差异具有统计学意义(P＜0.05)。对阳性关联位点A-20C进行性别、年龄的分层分析，在男性群体及年龄大于50岁的人群中，AC基因型频率与C等位基因频率均显著高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。相对风险分析发现，携带C等位基因的人发生ICVD的危险性增加，OR=1.511，95％CI为(1.018～2.242)。单倍型分析发现：ICVD组AGT基因的—20A／-6G／174C／235T单倍型频率显著低于对照组，P=0.000，OR=0.616，95％C／为(0.466～0.813)，ICVD组—20C／-6G／174C／235T单倍型频率显著高于对照组，P=0.044，OR=1.598，95％CI为(1.009～2.532)。配对连锁不平衡分析发现：G-6A和M235T间为绝对的连锁不平衡(D’=1.000)；G-6A和A-20C、A-20C和T174M、T174M和G-6A之间具有强的连锁不平衡(D’＞0.8)。河南汉族人群的G-6A和M235T的基因频率与日本人群和欧美白人之间具有非常显著的差异(P＜0.0000)。第三部分同型半胱氨酸代谢酶基因多态性与缺血性脑血管病的关联研究方法：选取缺血性脑血管病患者412例，诊断标准与第一部分相同。其中脑血栓形成354例，腔隙性脑梗塞23例，短暂性脑缺血发作35例；男250例，女162例，平均年龄60.58±11.62岁。选自同期健康体检的随机个体500例，其中男274例，女226例，平均年龄54.68±10.44岁。以上两组均为无血缘关系的河南地区汉族个体，排除癫痫、癌症及肝肾功能不全者。对每一位入选者均通过问卷调查表收集相应的人口统计学资料、用药史、吸烟与饮酒情况及家族史等资料，所有受试者均签署了知情同意书。采用PCR-RFLP的分型方法对亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR／C677T)、胱硫醚合成酶(CBS844ins68)以及蛋氨酸合成酶(MS／A2756G)基因多态性进行检测。数据资料运用SPSS12.0软件进行统计分析，基因型频率及等位基因频率的比较、相对危险度估算、Hardy-Weinberg平衡检验、单倍型频率计算、连锁不平衡分析等均与第一部分相同。结果：单位点关联分析发现：MTHFR／C677T位点的CT、TT基因型频率以及T等位基因频率均显著高于对照组(P=0.000)。对MTHFR／C677T位点进行年龄、性别的分层分析，发现在男性中TT基因型频率显著高于对照组，差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)。相对风险分析发现，基因型为CT、TT的人发生ICVD的危险性显著增加，CT的OR=2.303，95％CI为2.303(1.627～3.261)；TT的OR=2.264，95％CI为(1.592～3.218)。对MTHFR／C677T与MS A2756G位点进行单倍型分析，ICVD组中677T-2756A单倍型频率显著高于对照组(P＜0.00000)，OR=1.539，95％CI(1.287～1.839)。而677C-2756A单倍型频率明显低于对照组(P＜0.00000)，OR=0.660，95％CI(0.551～0.790)。对MTHFR／C677T与MS A2756G位点做配对连锁不平衡检验，D’=0.012，r~2=0.000。河南汉族人群MTHFR／C677T、CBS844ins68基因频率与美国白人差异显著(P＜0.05)。逐步Logistic回归分析显示MTHFRC677T是ICVD发生的主要危险因素。结论1．ALOX5AP基因SG13S114位点、AGT基因的A-20C位点以及MTHFR／C677T位点与缺血性脑血管病的发生密切关联，可能是河南汉族人群缺血性脑血管病的遗传易感因子。并且在男性ICVD患者中关联更为显著。2．河南汉族人群青年缺血性脑血管病患者的发病可能与SG13S114位点的不同基因型有关。3．河南汉族人群老年缺血性脑血管病患者的发病可能与AGT基因的A-20C位点的不同基因型有关。4．ALOX5AP基因的SG13S377G／SG13S114A／SG13S41A／SG13S35G单倍型、AGT基因的—20C／-6G／174C／235T单倍型以及MTHFR677T／MS2756A单倍型可能是河南汉族人群ICVD发生的风险单倍型。5．ALOX5AP基因的SG13S377T／SG13S114G／SG13S41G／SG13S35A单倍型、AGT基因的—20A／-6G／174C／235T单倍型以及MTHFR677C／MS2756A单倍型可能对河南汉族人群ICVD的发生具有保护作用。6．ALOX5AP基因SG13S114和SG13S377、SG13S32和SG13S377位点之间具有强连锁不平衡；AGT基因的G-6A和M235T位点间为绝对的连锁不平衡；G-6A和A-20C、A-20C和T174M、T174M和G-6A位点之间也具有强的连锁不平衡。7．SG13S35、G-6A、M235T、MTHFR／C677T位点的基因频率存在较大的种族和地区差异，欧美白人的基因频率与河南汉族人群有显著差别。