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目的:小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）是一种革兰阴性无芽胞杆菌,属于肠杆菌科耶尔森菌属,是耶尔森菌属中的三大致病菌之一,可通过水和食品传播以胃肠道症状为主的疾病。和其他肠杆菌科细菌一样,Y.enterocolitica染色体携带ampR-ampC基因,表达产生AmpCβ-内酰胺酶,从而对部分青霉素类和头孢类抗生素产生天然耐药。然而,尽管肠杆菌科细菌AmpC β-内酰胺酶表达调控机制研究较早,但目前尚没有报道Y.enterocolitica ampC表达调控机制的文献。因此,本研究通过分子生物学、免疫学及微生物学技术对Y. enterocolitica AmpC β-内酸胺酶表达调控机制进行研究,旨在进一步阐明该菌的耐药机制。方法:1.采用生物信息学技术对ampC上游的启动子区进行预测,利用PCR方法扩增预测序列,将扩增产物与原始质粒pBBRLux连接,构建重组质粒pLUXampC。该质粒可根据ampC基因的启动子强弱而发出相应的生物冷光,可用于指示细菌AmpC β-内酰胺酶的表达量。2.采用BLAST程序寻找可能的Y.enterocoltica AmpD蛋白、低分子量青霉素结合蛋白（Low-Molecular-Mass Penicillin-Binding Proteins）以及β-N-乙酰葡萄糖胺酶（NagZ）编码基因。通过无缝克隆技术将目的基因的上、下游同源臂（约1000bp）连接至自杀质粒敲除载体pDS132,通过无痕敲除技术构建相关目的基因缺失株。3.将ampC启动子活性检测质粒pLUXampC转化到相应的ampD1、ampD2、ampD3、pbp4、pbp5a、pbp5b、pbp7、ampR 以及 nagZ缺失株中。常规培养后,检测细菌的生物发光强度,以判断各缺失株AmpC β-内酰胺酶的表达量。4.将处于对数生长期的细菌超生破碎,离心后取上清液,获得细菌酶粗提物。分别使用头孢硝噻吩和4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide作为反应底物,对待测菌株粗提物种的β-内酰胺酶活性和β-N-乙酰葡萄糖胺酶（NagZ）活性进行测定。5.采用微量肉汤稀释法测定各缺失株的抗生素最低抑制浓度（MIC）。结果:1.成功构建基于生物发光技术的ampC启动子活性检测质粒,并命名为pLUXampC。2.根据蛋白质序列的同源性分析得知Y. enterocolitica 105.5R（r）中WP005156822、WP005164953 和 WP013649890 这三个蛋白均具有与 AmpD相同的蛋白功能结构域,将其命名为AmpD1、AmpD2和AmpD3,并构建了七种与之相关的单、双、三基因缺失株。AmpD1、AmpD2和AmpD3均为有功能的AmpD同系物蛋白,同时参与ampC的表达调控。AmpD蛋白缺失会导致细菌β-内酰胺酶活性的增高,三基因缺失株YE△D123则出现了完全去阻遏持续高产AmpC β-内酰胺酶的表型特点。3.构建了15种与低分子量青霉素结合蛋白（LMMPBPs） PBP4、PBP5a、PBP5b和PBP7相关的单、双、三、四基因缺失株。发现以PBP5b为首的LMM PBPs对细菌ampC调控起关键作用。各缺失株的ampC启动子活性出现不同程度的升高,四基因缺失株YEA4A5aA5bA7出现了与YEAD123相似的持续高产AmpC β-内酰胺酶表型。4.为比较上述两AmpC过表达菌株的区别,将YE△D123和YEA4A5aA5bA7的β-N-乙酰葡萄糖胺酶基因（nagZ）敲除,发现该基因的敲除对于YE△D123无影响,而对YEA4A5aA5bA7的影响较大,nagZ基因缺失株YE△4A5aA5b△7△Z的β-内酰胺酶活性降低至野生株相同水平。结论:1.通过构建重组质粒pLUXampC建立了基于生物发光技术的细菌ampC表达水平检测方法。该方法可在不影响细菌活性的情况下对细菌的AmpC β-内酰胺酶表达量进行监测;2.Y.enterocolitica可通过三个AmpD同系物对细菌的AmpC β-内酰胺酶进行调控。其中AmpD1功能较强,单缺失株YE△D1（ampD 缺失）的AmpC酶表达量即出现明显的上升;而AmpD2和AmpD3功能相对较弱,其负调控功能只有在双、三基因缺失株中才能体现,在肠杆菌科细菌中发现多AmpD参与的ampC逐级调控机制;3.Y.enterocolitica的四种低分子量青霉素结合蛋白（LMM PBPs）均参与细菌AmpC β-内酰胺酶的表达调控,LMM PBPs缺失会导致细菌AmpC β-内酰胺酶表达量不同程度的上调。其中以PBP5b的功能最强,单缺失株YE△5b的β-内酰胺酶活性即出现明显上升;而PBP4、PBP5a和PBP7的功能相对较弱,主要与PBP5b相协同而发挥作用:4.Y.enterocolitica具有NagZ依赖/NagZ非依赖两种AmpC β-内酰胺酶调控途径。