论文部分内容阅读
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种急性传染病,可引起猪只急性腹泻并迅速脱水、死亡,对哺乳仔猪危害最大。2010年来,PED在世界各地大规模暴发。毒株变异是导致该疫情难以控制的主要原因之一。本研究应用PK-15细胞在腹泻哺乳仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR检测、琼脂糖凝胶扩散试验对细胞培养物进行鉴定,证明获得一株PEDV毒株,命名为SNJ-P。该病毒可在胰酶终浓度为4μg/mL的病毒培养液中培养,盲传至第4代产生细胞病变。继续传代至第7代,细胞稳定出现CPE。传代至第10代,出现CPE时间提前至接毒后12 h。将第15代细胞病毒液收集进行蚀斑纯化,计算出SNJ-P的TCID50为1×10-6.5/mL。观察SNJ-P人工感染哺乳仔猪后的病理学变化及检测各组织器官内病毒核酸载量,制作主要病变器官病理切片。结果表明除肠道以外,肺脏与肝脏内病毒核酸载量最高,呈肠道>肺脏>肝脏。比对多条参考株全基因组序列,设计21对扩增PEDV全基因组序列的引物,扩增SNJ-P分离株的全基因序列。分析各基因片段遗传与变异情况,讨论变异可能造成其产物功能上的变化,从基因层面分析目前疫苗免疫效果不理想原因,为新的疫苗的研发提供理论帮助。建立全基因进化树,分析该毒株与参考毒株的分子遗传进化关系。结果显示SNJ-P与中国株ZL29、CH/HNYF的同源性最高,同源性为98.4%和98.7%。与俄罗斯株Blegorod亲缘关系较远,同源性为90.9%。对分离毒株的S基因进行分析,设计了1对引物扩增其抗原性较高的抗原决定簇基因区（689794 aa）,构建pET-32a（+）-SJ重组表达质粒。诱导表达得到大小为35 kD的重组S蛋白,鉴定其为包涵体,利用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒对该蛋白进行纯化,获得浓度为1.145 mg/mL的重组蛋白。对其进行Western-blotting鉴定,证明其具有良好的抗原性。将纯化的重组蛋白作为包被抗原,优化各反应条件,建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法。判定标准为OD450nm≥0.324为阳性,反之为阴性。与市售试剂盒符合率为96.67%。该方法特异性良好,重复性高,且成本低。可用于临床PEDV血清抗体检测以及PEDV流行病学的监测,对本病的预防具有重要意义。