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目的:在人类基因组中,有98%的DNA序列属于非编码序列,非编码序列中大约有一半的序列属于重复序列,Alu是人类基因组中除LINE-1(long interspersed nuclear elements 1,长散在重复序列核元件1)以外最主要的重复序列家族。多腺苷化信号又称PolyA信号(Polyadenylation signal),AAUAAA(在基因组序列中表示为AATAAA)是其主要形式,参与真核mRNA 3’端形成的重要过程。已知Alu序列和PolyA信号与多种生物学现象关联,如Alu的插入或缺失可引起肿瘤、染色体重组等;而一大类导致地中海贫血的血红蛋白病都归因于AAUAAA这个序列的点突变。本文中在pEGFP-C1载体的GFP绿色荧光蛋白基因下游插入了14个同向串连的Alu序列,构建p-Alu14质粒。又在p-Alu14质粒GFP基因下游按正、反方向插入SV40(Simian Virus 40,猴空泡病毒40)PolyA序列(240bp)及去除AATAAA的PolyA序列。将这些质粒转染Hela细胞,观察上游GFP报告基因绿荧光蛋白表达变化来揭示Alu14序列、SV40 PolyA序列以及AATAAA信号对上游序列表达的影响及其作用规律,为进一步研究Alu及PolyA信号的作用机制奠定实验基础。方法:1 p-A-Alu14和p-Aas-Alu14载体构建与鉴定设计上、下游均含有HindⅢ酶切位点的PCR引物,以pEGFP-C1载体为模板,PCR扩增位于其多克隆位点下游的SV40 PolyA(以下简称PolyA)序列。将回收纯化的PCR产物从HindⅢ酶切位点连接至p-Alu14质粒,经酶切、PCR及测序鉴定,得到正、反序列PolyA插入的质粒。PolyA正向插入命名为p-A-Alu14,反向插入命名为p-Aas-Alu14。2 p-ΔA-Alu14重组质粒的构建与鉴定已知正序PolyA序列中有两个AATAAA序列,为去除它们,先以pEGFP-C1载体为模板,PCR扩增PolyA序列中第一个AATAAA的上游序列PolyAa和第二个AATAAA下游的序列PolyAb。再以重组PCR法融合PolyAa和PolyAb的DNA片断,制成去除AATAAA的正序PolyA即?A序列。后续的构建及鉴定步骤类似p-A-Alu14质粒。构建好的质粒命名为p-?A-Alu14。3 p-?Aas-Alu14重组质粒的构建与鉴定已知反序PolyA序列中有一个AATAAA序列,PCR分别扩增PolyA序列中AATAAA的上游序列PolyAaas和AATAAA的下游序列PolyAbas。重组PCR法融合PolyAaas和PolyAbas的DNA片断,制成去除AATAAA的反序PolyA即?Aas片断。后续构建步骤同上。构建好的质粒命名为p-?A-Alu14。4转染Hela细胞及计数将上述四种质粒、p-Alu14和pEGFP-C1以脂质体法分别转染Hela细胞,荧光显微镜下计数观察GFP荧光阳性细胞数,在白光和荧光下分别照相。每种转染细胞计数6个样本,每个样本计数细胞总数至少500个,计算荧光阳性细胞百分率。结果: 1重组质粒p-A-Alu14和p-Aas-Alu14的鉴定构建质粒经核酸内切酶酶切分析,PCR分析和测序后可知,重组质粒p-A-Alu14和p-Aas-Alu14中所插入的片段与预期长度一致,核苷酸序列正确无误。2重组质粒p-A-Alu14和p-Aas-Alu14的鉴定去除AATAAA序列的重组质粒p-ΔA-Alu14和p-ΔAas-Alu14的测序结果显示,重组质粒中所插入的片段是去除AATAAA序列的SV40 PolyA正、反序,核苷酸序列正确无误。3转染后Hela细胞的荧光计数及分析各质粒瞬时转染Hela细胞,荧光细胞阳性率均值分别为: p-Alu14 (0.10±0.02608)% P-A-Alu14 (4.05±0.32094)% p-Aas-Alu14 (5.08±0.30605)% p-ΔA-Alu14 (2.08±0.19918)% p-ΔAas-Alu14 (4.03±0.24221)% pEGFP-C1 (26.5±1.01587)%由此可见,在pEGFP-C1的GFP基因下游插入14个串连的Alu序列后,荧光阳性率由( 26.5±1.01587 ) %变为(0.10±0.02608)%,下降十分明显。PolyA正向插入p-Alu14构成的p-A-Alu14质粒,转染细胞荧光阳性率(4.05±0.32094)%,PolyA反向插入p-Alu14后构建的p-Aas-Alu14质粒,转染细胞荧光阳性率(5.08±0.30605)%,二者均高于p-Alu14转染的阳性率(0.10±0.02608)%(P<0.01)。去除正序PolyA的AATAAA后构成的p-ΔA-Alu14质粒和去除反序PolyA的AATAAA构建的p-ΔAas-Alu14质粒,转染细胞荧光阳性率分别为(2.08±0.19918)%和(4.03±0.24221)%,二者仍然高于p-Alu14转染的阳性率(P<0.01)。结论:1成功构建了在p-Alu14载体中分别插入SV40 PolyA正、反序的重组质粒。2成功构建了在p-Alu14载体中分别插入去除AATAAA信号后的SV40 PolyA正、反序的重组质粒。3 p-Alu14质粒中插入的Alu14序列显著抑制上游GFP报告基因表达。4 p-Alu14的载体GFP基因下游按正、反方向插入SV40 PolyA后,原本受Alu14抑制的GFP基因表达明显升高,SV40 PolyA正、反序一定程度上解除了Alu14的抑制作用。5 PolyA正、反序列去除AATAAA后尽管上调受Alu14抑制的GFP基因表达的幅度较未去除前有所减小,但仍然可以上调其表达,这提示SV40 PolyA序列上调基因表达可能还受AATAAA以外其他因素影响。