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丝状子囊菌里氏木霉能够分泌一系列的纤维素酶,并且因其高产的纤维素酶特性而被广泛地应用于生产生物燃料、造纸和饲料加工等领域,已成为研究最多的产纤维素酶的微生物之一。然而,在里氏木霉中,葡萄糖存在会触发碳分解代谢抑制（carbon catabolite repression,CCR）,从而严重下调纤维素酶基因的转录水平。因此,如何减弱CCR是高效生产纤维素酶的一个重要科学问题。木质素对纤维素酶的非产出性吸附极大地降低了木质纤维素的酶解效率。因此,许多科学家集中在研究木质素非产出性吸附的机制,以及如何提高纤维素酶对纤维素/木质素的分配系数比以此来提高木质纤维素的酶解效率和降低纤维素酶制剂的成本。本文的研究内容及成果如下:1.构建纤维素酶自诱导体系提高Cel7A的产量在里氏木霉中,GH1家族的β-葡萄糖苷酶-cel1a或cel1b在菌丝形态和纤维素酶生产中起着非常重要的作用。与出发菌株相比,敲除cel1a对菌株的产孢和纤维素酶的产量没有明显影响,然而,cel1b的缺失会导致菌株的生长缺陷和纤维素酶的转录产生严重的下调,cel1a和cel1b的双缺失会加剧上述生长和纤维素酶转录的抑制。本实验通过将 Cel1b突变体-Cel1bI174S/I177S 替换了 Cel1b,构建了 M5:ΔCel1b::Cel1BI174S/I177S、M6:ΔCel1b::OE Cel1BI174S/I177S、M7:ΔCel1a＆ΔCel1b::Cel1BI174S/I177S 和 M8:ACel1a＆ACel1b::OE Cel1BI174S/I177S四种菌株。结果显示,与出发菌株相比,M5-M8的表型基本没有变化,但当在纤维素和葡萄糖混合碳源培养条件下,纤维素酶Cel7A产量得到了较大程度的提高。因此,在调控表型和纤维素酶合成方面,Cel1a与Cel1b功能明显不同。Cel1b在里氏木霉纤维素酶的转录调控中起着积极作用,Cel1b的缺失会导致菌株形态学和纤维素酶生产抑制。在葡萄糖培养条件下,Cel1b的改造能够较大程度上提高纤维素酶的表达水平,减弱CCR。2.改造里氏木霉转录因子Cre1提高Cel7A的表达在里氏木霉中,葡萄糖的存在主要通过Cre1触发CCR,从而严重下调纤维素酶的转录水平。许多研究集中在修饰Cre1以缓解CCR。本研究通过对野生型草酸青霉114-2（Po-0）和纤维素酶高产的草酸青霉菌株JUA10-1（Po-1）的CreA进行同源比对,构建了一株C末端替代菌株Po-2。在葡萄糖培养条件下,与亲本菌株相比,菌株Po-2的纤维素酶cel7a转录水平受到明显的抑制,从而证明了 CreAPo-1的C末端在缓解CCR中起着非常重要的作用。进一步的,在里氏木霉中,将Cre1的C末端替换为CreAPo-1的C末端,构建菌株Tr-1;作为对照,Cre1的C末端被截短,构建菌株Tr-2。结果显示,在葡萄糖存在的条件下,Cre1/CreA的C末端嵌合体极大的提高了纤维素酶的转录和表达水平,减弱了CCR。进一步的,为了探究Cre1的C末端关键的磷酸化位点,对来自十种产纤维素酶真菌的Cre1/CreA/CreT的C末端进行了保守性分析,结果显示C末端存在高度保守的多达三个连续的S/T磷酸化位点。基于此,本研究将里氏木霉Cre1的C末端的四个保守氨基酸位点-S387、S388、T389和T390-突变为氨基酸V,以模拟去磷酸化,构建了转化子 TrCre1s387V,TrCre1S388V,TrCre1T389V,and TrCre1T390V。与出发菌株和其他转化子相比,当在葡萄糖存在的条件下,转化菌株TrCre1S388V的纤维素酶cel7a的转录水平产生了较大程度的提高,滤纸酶活FPase和pNPCase活性以及可溶性蛋白浓度提高了 2-3倍。最后,对Cre1的C末端可能的磷酸化路径进行了分析,结果表明,S388位点磷酸化并不受到营养传递路径MAPK的调控,而是很可能受到PKA路径的调控,进一步调控CCR。总之,结果证明了Cre1的C末端嵌合体和CCR有着直接的关系,并且开发出了一种在CCR下通过修饰转录因子Cre1的磷酸化形式从而增强真菌纤维素酶表达水平的精确设计策论。3.通过添加化学品提高Cel7A降解木质纤维素的效率木质素对纤维素酶的非产出性吸附严重抑制了木质纤维素的水解效率。在这项研究中,通过对Cel7A的CBM理性设计以及生物信息学分析,构建了一个快速荧光检测（RFD）系统。利用RFD系统,证明了与添加Tweens或PEGs相比,添加阳离子添加剂DTAB或polyDADMAC极大的增加了纤维素/木质素的分配系数比,减少了木质素的非产出性吸附,增强了木质纤维素的酶解效率。此外,polyDADMAC或DTAB的添加分别使MCL（mixture of Avicel and lignin）释放的葡萄糖产量分别提高了 16.9%和20.6%,同时证明了添加polyDADMAC或DTAB更有利于增效预处理的木质纤维素的酶解效率。进一步,通过疏水性实验以及zeta电位实验证明了降低的疏水性和增加的zeta电位协同减弱了木质素的非生产性吸附。证明了疏水性和电荷相互作用是导致非产出性吸附的关键因素。这项工作将有助于减弱纤维素酶与木质素的非产出性结合,增效木质纤维素的酶解效率,同时为纤维素酶CBM区的改造提供理论基础。