玉米(Zea mays L.)是世界上重要的粮食作物之一,也是中国的三大作物之一,相比水稻和小麦,玉米对环境的适应性强,种植范围更广,在饲料、工业和能源原料等方面都发挥着重要的作用.叶片是植物重要的器官,也是植物最有特征的结构之一,叶片的发育与农作物的产量密切相关.叶片的同化功能与叶片的大小有密切关系,提高叶片的光合性能、增加叶片光合面积是提高作物产量的重要措施之一.叶片发育就是其形态、结构逐渐建成以及光合功能不断完善的过程.当叶片发生突变时,无论是形态还是功能,势必会对光合及呼吸作用造成一定影响,从而影响玉米的产量.　　本实验所用的玉米突变体材料是田间自然突变,经多代自交后,突变表型可稳定遗传,命名为叶片破裂突变体rg-54948(ragged leaf-54948).在田间正常生长条件下,叶片破裂突变体rg-54948的叶片在五叶期以前与野生型并无差异.到六叶一心期左右,突变体的叶片开始出现若干裂口,局部叶片开始皱缩,此突变表型会一直保持到生长期结束.叶片突变表型只在突变体植株的中上部叶片出现,下部的叶片表现为正常表型.　　为了观察叶片突变部位的细胞结构,在叶片破裂突变体rg-54948刚出现表型时,对叶片破裂突变体rg-54948叶片的的裂口部位、皱缩部位和野生型的正常叶片进行了石蜡切片的制作和观察,发现突变体的裂口部位形成大量薄壁细胞;皱缩部位的运动细胞向内异常伸长.上下表皮的表皮蜡质覆盖极不均匀,局部甚至没有表皮蜡质覆盖.　　对B73和1145的F2分离群体和BC1回交群体分别做了遗传分析发现,两个组合的回交群体均符合1∶1的分离比,F2代分离群体均偏离3∶1的分离比.通过花粉染色观察,发现叶片破裂突变体rg-54948的花粉活力不高,部分花粉甚至存在失活现象,是造成偏分离的原因.为了确定候选基因,利用BSA法对突变体进行定位.初定位用本实验室均匀分布在玉米10条染色体上的208对SSR引物,将目的区间定位在第5号染色体长臂p-mmc0081和p-bnlg278引物之间,物理距离14.87Mb.精细定位用77对SSR引物对3507个分离群体后代进行PCR扩增和电泳检测,最终将目的基因定位在R51和X1引物之间,物理距离3.72Kb,区间内有一个基因.　　经过测序发现,该基因在突变体的第5个外显子上有一小段51bp的插入片段,该片段为Popin的转座子家族,推测可能是该插入片段导致目的基因的蛋白活性改变,从而造成叶片破裂表型.利用MaizeGDB和NCBI等网站的DNA和蛋白质数据库,发现该基因大小5.5Kb,是一个反向基因,有32个转录本,编码长度为523个氨基酸的蛋白质.该蛋白有两个功能域:脂肪酸羟化酶结构域(Fatty acid hydroxylase domain)和WAX2_C结构域,属于脂肪酸羟化酶超家族.根据MaizeGDB数据库的预测,该基因主要有以下三种生物学功能:醛脱羰酶参与醛转化为烷烃、非常长链烷烃合成复合物的核心组分、参与角质层蜡的生物合成和控制花粉育性.根据UniProt蛋白数据库,预测到该目的基因有两种分子功能:参与铁离子运输和具有氧化还原酶活性.　　为了进一步验证叶片破裂突变体rg-54948候选基因的正确性,通过CRISPR-Cas9构建了敲除载体,对本实验进行转基因验证,目前尚未得到验证结果.