瑞士乳杆菌具有较强的蛋白水解能力,能在脱脂乳培养基中生长繁殖,但要实现高密度发酵培养,还需采取其它调控措施,如添加酵母膏,补充维生素,调节pH等。本研究发现,在脱脂乳培养基中补加乳糖,可以提高培养基中的菌体密度。这一方面说明脱脂乳培养基中氮源丰富,足以维持菌体生长繁殖,另一方面说明碳源相对不足,影响菌体细胞的增殖。因此,本研究从菌体细胞表观生长特性、相关代谢途径关键酶活性变化及基因转录水平、全细胞蛋白质组学、转录组学等方面,系统研究了碳源对菌体细胞生长代谢的影响,旨在从理论层面上揭示其中的机理,阐述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)相关代谢途径之间的内在联系,为后续高密度发酵调控提供理论依据和支持。通过乳糖调控优化培养方式,在以脱脂乳和酵母膏为基础的培养基中,瑞士乳杆菌细胞密度达到了3.98×109cfu/mL,取得了较好的增殖效果。本研究的主要结论如下：1、与乳清蛋白或酪蛋白培养基质相比,瑞士乳杆菌CICC22171在脱脂乳培养基中生长状态更好,菌体密度分别是乳清蛋白的5.4倍和酪蛋白的2.3倍,发酵过程中NaOH消耗量达141.2mL (7.5mol/L),活菌数为8.32×108cfu/mL。脱脂乳是瑞士乳杆菌培养的最佳氮源,发酵过程蛋白水解的SDS-PAGE电泳图也证实了这一点。进一步研究发现,当培养基中乳糖浓度由4.5%提高到8.0%时,活菌数升高到1.14×109cfu/mL,活菌数显著提高(p<0.01),这说明脱脂乳中碳源或许相对不足,从而影响了菌体的增殖。2、研究了乳糖对代谢途径关键酶：p-半乳糖苷酶(β-GAL),己糖激酶(HK),磷酸果糖激酶(PFK),丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响,从整体水平来看,增加乳糖浓度,瑞士乳杆菌细胞内相关酶活力明显升高,说明菌体细胞糖代谢旺盛,有利于菌体细胞的增殖。与此同时,利用荧光定量PCR对发酵过程中关键酶基因的表达水平进行了检测。结果发现,PK和LDH的基因在8h的表达量分别提高了16.015倍和8.444倍,反映出细胞内丙酮酸大量合成,说明细胞内物质丰富,有利于细胞分裂繁殖。3、利用双向电泳及串联质谱分析(2D-Maldi-TOF-TOF-MS)对不同糖浓度培养条件下的菌体细胞全蛋白进行了检测。经分析,共发现13个差异表达蛋白点,其中11个得到了鉴定,主要涉及糖代谢、氨基酸合成、核苷酸合成、物质转运等过程。4、通过转录组测序(RNA-Seq)技术分析了瑞士乳杆菌在两种培养基(高糖和低糖)中培养时的差异基因表达情况,获得差异表达基因1979个,其中上调基因为1250个,下调基因为729个。按阀值log2Ratio>1进行显著差异筛选,获得307个显著上调基因,167个显著下调基因。通过基因功能注释,1621个基因注释到GO(gene ontology)中,其中上调基因885个,下调基因766个。进行显著差异筛选后,241个基因注释到KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)。通过差异表达基因的GO功能富集分析和KEGG代谢途径分析发现,菌株CICC22171在高糖培养基中生长发生转录上调的基因主要参与脂肪酸合成、氨基酸合成、跨膜转运、能量代谢等生命过程。转录下调的基因主要参与DNA限制性修饰、DNA甲基化、糖异生等过程。说明瑞士乳杆菌在高糖培养基中发酵时,代谢相关基因表达水平较高,代谢更旺盛,有利于菌体细胞的快速增殖。5、通过调节乳糖浓度,以脱脂乳添加酵母膏为基础培养基,选择合适的培养方式,控制温度、pH值和转速等参数进行发酵试验。结果表明,补料分批培养为最佳培养方式,与碱性中和相结合,可以实现菌株的高密度培养,最终的活细胞数可达3.98×109cfu/mL,是分批培养和连续培养的2.15倍和1.88倍,增殖效果显著。此外,研究发现菌株CICC22171对氧气较敏感,因此,发酵过程中应严禁通气,同时选择较低的搅拌转速,以改善细胞增殖水平。