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第一章脊髓神经元细胞自噬的鉴定及机械损伤对细胞自噬和凋亡的影响目的：脊髓神经元细胞机械性损伤后自噬的鉴定，观察机械性损伤对脊髓神经元细胞自噬及凋亡的影响。方法：（1）采用阙海萍介绍的方法建立原代脊髓神经元细胞机械损伤模型；（2）HE染色以及NSE和DAPI荧光双标记观察神经元细胞形态；（3）构建pcDNA-3.1(+)-GFP-LC3重组质粒，采用荧光显微镜观察荧光斑点；电镜观察细胞超微结构，MDC、AO荧光染色，Western Blot检测Beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达对细胞自噬进行鉴定；（4）MTT法观察机械损伤对细胞活性的影响；（5）流式细胞仪检测机械损伤对细胞周期和凋亡的影响；（6）Western Blot检测机械损伤对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响；结果：（1）机械损伤处理后可见大部分神经元细胞轴突和树突被切断，3h后细胞培养瓶中出现大量漂浮细胞；（2）HE染色显示神经元细胞轴突和树突清晰，纯度大于90%；（3）NSE和DAPI荧光双标记可明显看到NSE绿色荧光和DAPI红色荧光，神经元细胞形态完整；（4）成功构建pcDNA-3.1(+)-GFP-LC3重组质粒并转染至神经元细胞中；（5）机械损伤24h后荧光显微镜下观察到转染细胞内出现明显的绿色斑点积聚；（6）MDC及AO荧光染色显示机械损伤24h后神经元细胞出现大量自噬空泡；电镜下观察到自噬体及凋亡小体形成；（7）机械损伤24h后神经元细胞中Beclin-1的表达量及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值都达到高峰；（8）细胞死亡率随损伤时间的延长逐渐增加，24h后细胞死亡率有所减少；（9）细胞凋亡率随损伤时间的延长逐渐升高，3h后细胞凋亡率有明显升高；（10）随着损伤后时间的增加，Bcl-2蛋白表达水平先增加，3h后逐渐减少，而Bax蛋白表达水平随损伤时间逐渐增加；结论：（1）机械损伤会诱发神经元细胞自噬的产生，自噬活性在损伤后24h达到高峰；（2）机械损伤会促使神经元细胞凋亡和坏死，降低细胞的存活率；（3）神经元细胞在自噬发生前期可能通过促进Bcl-2的表达或抑制Bax的表达来抑制细胞凋亡；（4）采用损伤24h作为后期药物处理时间点。第二章自噬调控对机械性损伤诱导的脊髓神经元细胞自噬及凋亡影响目的：探讨自噬调控对机械性损伤诱导的神经元细胞自噬及凋亡影响。方法：（1）分别采用雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤促进和抑制细胞自噬活性；（2）Western Blot检测自噬及凋亡相关蛋白的表达水平；（3）RT-PCR检测LC3和Beclin-1的mRNA水平；（4）MTT检测自噬调控对细胞活力的影响；（5）流式细胞仪检测自噬调控对细胞凋亡的影响；结果：（1）雷帕霉素明显增加了神经元细胞机械损伤后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的蛋白表达水平，而3-MA在一定程度上降低了神经元细胞机械损伤后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的蛋白表达水平；（2）雷帕霉素明显增加了神经元细胞机械损伤后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的mRNA水平，而3-MA在一定程度上降低了神经元细胞机械损伤后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin-1的mRNA水平；（3）雷帕霉素降低了机械损伤后神经元细胞的死亡率，而3-MA提高了细胞的死亡率；（4）雷帕霉素降低了机械损伤后神经元细胞的凋亡率，而3-MA提高了细胞的凋亡率；（5）雷帕霉素降低了机械损伤后神经元细胞Bax的表达，而3-MA增加了Bax的表达；雷帕霉素增加了机械损伤后神经元细胞Bcl-2的表达，而3-MA在一定程度上降低了Bcl-2的表达；（6）机械损伤后神经元细胞中p-mTOR和p-AKT的表达水平明显降低，mTOR和AKT的表达水平略有升高；（7）雷帕霉素明显降低了p-mTOR和p-AKT的表达水平。结论：（1）雷帕霉素提高了神经元细胞的自噬活性，而3-MA在一定程度上抑制了细胞的自噬活性；（2）雷帕霉素在一定程度上可抑制神经元细胞凋亡和坏死，而3-MA则促进了细胞凋亡和坏死；（3）雷帕霉素抑制神经元细胞凋亡可能是通过增加Bcl-2的表达，降低Bax的表达来实现；相反，3-MA促进细胞凋亡可能是通过增加Bax的表达，降低Bcl-2的表达来实现；（4）雷帕霉素促进神经元细胞自噬可能通过下调mTOR和AKT磷酸化水平来实现的。第三章Beclin-1基因在机械性损伤诱导的神经元细胞自噬及凋亡中的作用目的：探讨Beclin-1基因在机械性损伤诱导的神经元细胞自噬及凋亡中的作用。方法：（1）构建过表达Beclin-1重组质粒pcDNA-3.1(+)-Beclin-1和沉默Beclin-1表达重组质粒pcDNA-3.1(+)-miRNA，转染细胞后采用Western Blot验证；（2）Western Blot检测自噬及凋亡相关蛋白的表达水平；（3）MTT检测过表达和沉默Beclin-1对细胞活力的影响；（4）流式细胞仪检测过表达和沉默Beclin-1对细胞凋亡的影响。结果：（1）成功构建了过表达Beclin-1重组质粒pcDNA-3.1(+)-Beclin-1和沉默Beclin-1表达重组质粒pcDNA-3.1(+)-miRNA；（2）转染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1质粒的细胞中Beclin-1表达水平明显升高，而转染pcDNA-3.1(+)-miRNA质粒的细胞中Beclin-1表达水平明显降低；（3）转染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1质粒的神经元细胞中损伤24h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显增大，而转染pcDNA-3.1(+)-miRNA质粒的神经元细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显减小；（4）转染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1质粒的神经元细胞损伤24h后的死亡率有所降低，而转染pcDNA-3.1(+)-miRNA质粒的神经元细胞的死亡率有所升高；（5）转染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1质粒的神经元细胞损伤24h后的凋亡率有所降低，而转染pcDNA-3.1(+)-miRNA质粒的神经元细胞的凋亡率有所升高；（6）转染pcDNA-3.1(+)-Beclin-1质粒的神经元细胞损伤24h后Bcl-2表达量增加，Bax的表达量减少；而转染pcDNA-3.1(+)-miRNA质粒的神经元细胞损伤24h后Bax表达量增加，Bcl-2的表达量减少。结论：（1）过表达Beclin-1可能会促进神经元自噬，而沉默Beclin-1可能会抑制自噬的发生；（2）过表达Beclin-1一定程度上会抑制神经元细胞凋亡和坏死，而沉默Beclin-1会促进细胞凋亡和坏死；（3）Beclin-1抑制神经元细胞凋亡可能是通过上调Bcl-2和下调Bax的表达来实现的，Beclin-1促进细胞凋亡可能是通过上调Bax2和下调Bcl-2的表达来实现的。