暗发酵厌氧生物制氢能够将处理高浓度有机废水与产氢有效结合,具有发酵底物来源广泛、转化率高、产氢能力强、不需要光照等优点,成为近年来环境保护和能源领域研究热点之一。筛选高效产氢菌株,开展产氢细菌代谢组学研究,对了解产氢菌产氢机理和提高产氢效率具有重要意义。本实验以连续流搅拌槽式反应器（CSTR）进行厌氧发酵制氢,实验过程中考察了水力停留时间（HRT,12h、10h和8h）和进水COD浓度(3000 mg·L^-1、5000 mg·L^-1和7000 mg·L^-1)对反应器运行效率的影响,探讨了反应器运行过程中COD去除率、p H、出水悬浮物（TS）、活性污泥悬浮物固体质量浓度（MLSS）和可挥发悬浮物固体质量浓度（MLVSS）变化情况。借助高通量测序技术分析反应器内活性污泥中微生物菌群结构及其演变过程。利用Hungate滚管技术从活性污泥中筛选到一株高效产氢菌株,进而基于质谱与气相色谱联用（GC-MS）技术分析了该菌株在不同Fe²⁺浓度培养条件下差异代谢物的丰度变化。结果表明,当进水COD浓度控制在3000 mg·L^-1左右时,HRT为10 h时反应器运行效果最好,HRT过长或过短都会对反应器的运行造成负面影响。此阶段COD去除率在30%左右,p H稳定在4.6～4.7之间,累计产氢量约2 L·d^-1,末端液相发酵产物总质量浓度为1089 mg?L^-1,以乙酸为主,形成乙酸型发酵。产氢菌产乙醇杆菌属（Ethanoligenens）、巨球型菌属（Megasphaera）、肠杆菌属（Enterobacter）和梭菌属（Clostridium）等丰度占活性污泥中微生物总量的40%以上。若缩短HRT为8 h,COD去除率变化浮动较大且不稳定,累计产氢量下降。活性污泥沉降性能降低,大量污泥随出水流失,导致活性污泥生物量的流失。活性污泥中产氢菌丰度占比下降到16%左右。控制HRT为10 h,进水COD浓度为5000 mg·L^-1时获得最大累计产氢量且反应器运行良好。此条件下COD去除率在26%左右,p H稳定在4.5～4.6之间。液相发酵产物总质量浓度为2010 mg·L^-1,其中丁酸含量最高,为1300 mg·L^-1,形成丁酸型发酵。累计产氢量在2.5～3.0 L·d^-1左右。产氢菌产乙醇杆菌属（Ethanoligenens）和巨球型菌属（Megasphaera）丰度占比分别为18.57%和13.81%,产氢菌总丰度占比超过30%。当进水COD浓度为3000 mg·L^-1时,累计产氢量低,反应器的运行效率较差。当进水COD浓度进一步提升至7000 mg·L^-1时,有大量微生物因无法适应高浓度的有机底物而死亡,造成TS浓度上升和MLSS的浓度下降,累计产氢量由2.5～3.0 L·d^-1降低到1.6～1.7 L·d^-1。对活性污泥进行滚管分离筛选,筛选出一株高效产氢菌株编号为S-11,以LM-1为基础培养基,培养30h后累计产氢量为2230 m L/L-culture,比产氢率为0.89 mol H₂/mol glucose。经16S r DNA鉴定该菌株为肠杆菌属（Enterobacter）的一株新菌株。对该菌株进行不同Fe²⁺浓度培养优化,当Fe²⁺浓度为0.2 g·L^-1时,比产氢率最高,为1.09 mol H₂/mol glucose。当Fe²⁺浓度为0.5 g·L^-1,此时比产氢率最小,为0.61 mol H₂/mol glucose。选取无Fe²⁺培养条件下为对照组,0.2 g·L^-1 Fe²⁺和0.5 g·L^-1 Fe²⁺培养条件下为实验组,进行代谢产物分析。0.2 g·L^-1 Fe²⁺组和无Fe²⁺组之间共鉴定出83种差异代谢物,其中32种代谢物丰度显著上调,51种代谢物丰度显著下调。丰度上调的代谢物主要包括:参与电子转移的核黄素蛋白以及植物醇、苄胺、儿茶素、谷胱甘肽、4-氨基甲基环己烷羧酸等具有还原作用的物质。说明Fe²⁺可降低发酵环境中的氧化还原电位,有利于厌氧细菌的生长,从而提高肠杆菌S-11的发酵产氢能力。在0.5 g·L^-1 Fe²⁺组和无Fe²⁺组之间共鉴定出68种差异代谢物,其中22种代谢物丰度显著上调,46种代谢物丰度显著下调。代谢产物如苯胺、甘油和磷酸乙醇胺等参与氨基酸和脂类分解的物质丰度上升,参与细胞膜合成的亚油酸等脂类物质下降,说明过高的Fe²⁺浓度会给肠杆菌S-11带来一定的毒性,破坏细胞膜机构,导致产氢效果减弱。