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目的:在课题组前期工作基础上,检测TGF-β1对卵巢癌细胞自噬和线粒体自噬的影响;构建Lewis y抗原过表达或低表达的卵巢癌细胞系,检测TGF-β1的岩藻糖基化修饰对卵巢癌自噬和线粒体自噬的影响,并对其调控机制进行初步探讨,为卵巢癌的治疗寻找新的靶点提高理论依据。研究方法:1、通过Western blot检测不同浓度和时间点的TGF-β1作用下卵巢癌细胞自噬相关蛋白表达的变化。通过免疫荧光检测TGF-β1处理后卵巢癌细胞中LC3变化情况。添加自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)阻断自噬流,通过Western blot、免疫荧光等方法观察TGF-β1作用后卵巢癌细胞自噬流的变化情况。瞬时转染双荧光标记的LC3腺病毒后检测TGF-β1作用下卵巢癌细胞自噬流的变化情况。通过TMRM染色检测TGF-β1作用前后卵巢癌细胞线粒体膜电位变化情况。继而通过Western blot检测不同浓度和时间点TGF-β1作用下对卵巢癌细胞线粒体自噬发生的影响。通过免疫荧光检测TGF-β1作用下线粒体自噬相关蛋白PINK1的表达情况。通过Annexin V/FITC流式方法检测不同浓度TGF-β1作用下卵巢癌细胞凋亡发生情况。随之添加自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)后检测卵巢癌细胞凋亡发生水平的变化。2、首先分别转染FUT1质粒和shFUT1病毒,构建Lewis y抗原过表达和低表达卵巢癌细胞模型,检测Lewis y和TGF-β1的表达,并利用免疫共沉淀方法验证TGF-β1和Lewis y抗原结构关系。我们继而在此细胞模型的基础上重新检测第一部分方法内容。3、通过Western blot检测TGF-β1作用后卵巢癌细胞中TAK1蛋白表达。转染siTAK1后分别通过Western blot、免疫荧光、双荧光标记的LC3腺病毒、TMRM检测TGF-β1作用下干扰TAK1表达对卵巢癌细胞自噬、自噬流、线粒体膜电位及线粒体自噬发生的变化情况;同时检测相关通路变化情况。结果:1、随着TGF-β1处理浓度的升高自噬因子LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5和Atg7的表达水平也增高,同时p62的蛋白表达下调,并均呈浓度依赖性。不同时间点TGF-β1作用下,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7等在12、24、48h达到蛋白水平的峰值,p62则与时间呈负相关。用免疫荧光检测LC3的变化,TGF-β1作用后LC3荧光呈红色明亮小斑点,而未处理组荧光呈散在红色荧光。用CQ处理TGF-β1添加前后的细胞,TGF-β1处理后LC3的表达水平升高更明显,同时Beclin-1、Atg5、Atg7、p62等蛋白表达情况进一步验证了上述结果。免疫荧光检测下,TGF-β1组LC3的红色荧光小斑点增多更明显。用Ad-m RFP-GFP-LC3腺病毒转染细胞,与对照组相比,TGF-β1显著促进呈黄色荧光信号的自噬小体的积累。TMRM检测提示TGF-β1引起细胞线粒体膜电位去极化。不同浓度TGF-β1处理后,PINK1、Bnip3、Parkin等线粒体自噬蛋白表达均随着TGF-β1浓度升高而增高,呈浓度依赖性。不同时间点TGF-β1作用下,PINK1、Bnip3、Parkin等蛋白均在24h达到峰值;免疫荧光检测发现与对照组相比,TGF-β1作用24h后PINK1荧光明显增强,表达明显升高。流式检测发现,随着TGF-β1浓度的增加,卵巢癌细胞凋亡率亦增加,呈浓度依赖性;自噬抑制剂3-MA处理后可以部分逆转TGF-β1导致的细胞凋亡。2、FUT1基因转染后,细胞中Lewis y表达增加,TGF-β1及其上的Lewis y表达较转染前增加,同时发现自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5和Atg7的蛋白表达均增高,p62蛋白水平下调;同时促进TGF-β1对细胞自噬的作用。FUT1基因转染后,细胞TMRM染色荧光变弱,线粒体膜电位呈去极化;并促进了TGF-β1引起的线粒体膜电位去极化。FUT1基因转染后,线粒体自噬相关蛋白PINK1、Bnip3、Parkin等表达增高,且促进TGF-β1对线粒体自噬的作用。转染shFUT1后结果与之相反。shFUT1转染后,细胞凋亡率增高,部分逆转TGF-β1引起的细胞凋亡。3、TGF-β1作用下细胞中TAK1蛋白表达增加。在TGF-β1作用下,转染siTAK1后抑制卵巢癌细胞自噬以及线粒体自噬相关蛋白的表达和线粒体膜电位的去极化;FUT1基因转染后,部分逆转了上述现象。在TGF-β1作用下,转染siTAK1后,PI3K、Akt、ERK1/2无明显改变,但p-PI3K、p-Akt、p-ERK1/2表达明显下调;添加MEK或PI3K通路抑制剂后TAK1对自噬和线粒体自噬的作用下调。TGF-β1处理后,mTOR表达无明显改变,p-mTOR表达下调,FUT1基因转染后,p-mTOR蛋白下调更加明显,干扰TAK1后则减弱了p-mTOR蛋白的下调。结论:1、TGF-β1促进卵巢癌细胞自噬的发生,并呈浓度依赖性;引起细胞线粒体膜电位去极化,促进卵巢癌细胞线粒体自噬的发生。TGF-β1引起细胞发生凋亡,呈浓度依赖性;抑制自噬可以部分逆转TGF-β1诱导的细胞凋亡。2、TGF-β1存在Lewis y抗原修饰,且TGF-β1的Lewis y抗原修饰进一步促进卵巢癌细胞自噬的发生;加剧线粒体膜电位的去极化,增强线粒体自噬的发生。TGF-β1的Lewis y抗原修饰减弱TGF-β1诱导细胞凋亡的作用。3、TGF-β1通过TAK1诱导卵巢癌细胞发生自噬,引起膜电位的去极化以及线粒体自噬的发生,TGF-β1的Lewis y抗原修饰进一步促进上述作用。TGF-β1与其受体结合激活TAK1,通过磷酸化PI3K/Akt以及ERK1/2信号通路,调控下游mTOR蛋白的磷酸化,进而影响自噬和线粒体自噬相关蛋白的表达,从而调控自噬和线粒体自噬的发生。