第一部分 荷叶碱预防高脂膳食诱导肥胖的作用及其机制研究[研究目的]肥胖症及其相关代谢性疾病严重威胁人类健康。肝脏与脂肪组织中AMP依赖的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）调控的脂肪合成与分解在肥胖症的发生及进展中具有重要影响。传统中药荷叶具有抗肿瘤、抗炎等作用,本课题组前期研究发现,荷叶水提物能够降低高脂膳食（high-fatdiet,HFD）饲喂小鼠的脂肪含量。荷叶碱（Nuciferine,Nuci）是荷叶的主要有效单组分,但荷叶碱是否具有预防肥胖发生作用及其机制尚不明确。本研究旨在探讨荷叶碱预防HFD饲喂小鼠肥胖的作用,以及AMPK通路在其中的作用。[研究方法]本研究包含动物实验与细胞实验两部分。动物实验分为以下两个部分:1.荷叶碱干预方式与剂量的探索:分为两部分实验。第一部分,将不同剂量荷叶碱溶于羧甲基纤维素钠溶液灌胃干预小鼠,将HFD饲喂的C57BL/6J雄性小鼠随机分为四组:HFD对照组（Cont）,低剂量荷叶碱组（10mg/kg,Nuci-L）,中剂量荷叶碱组（20mg/kg,Nuci-M）,和高剂量荷叶碱组（30mg/kg,Nuci-H）,灌胃干预8周,进行腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT）和胰岛素敏感性试验（IPITT）,观察小鼠体重、摄食、脂肪含量、糖脂代谢等指标变化;第二部分,将不同剂量荷叶碱添加到小鼠饲料中饲喂干预,同上,将HFD饲喂的C57BL/6J雄性小鼠随机分为四组:HFD对照组（Cont）,低剂量荷叶碱组（0.06%,Nuci-L）,中剂量荷叶碱组（0.12%,Nuci-M）和高剂量荷叶碱组（0.24%,Nuci-H）,饲喂干预7周,同上观察小鼠体重、摄食、脂肪含量、糖脂代谢等指标变化。2.荷叶碱干预对HFD饲喂小鼠的作用:将C57BL/6J雄性小鼠随机分为四组:普通饮食对照组（ND）,高脂膳食对照组（HFD）,高脂膳食荷叶碱组（HFD-Nuci）和高脂膳食利拉鲁肽组（HFD-Lira）。荷叶碱组饲料添加0.10%的荷叶碱,利拉鲁肽组进行每日利拉鲁肽皮下注射,剂量为200μg/kg,共干预12周。同上进行IPGTT和IPITT试验,观察小鼠体质量、摄食、能量代谢、脂肪质量、糖脂代谢等的变化,检测血清中脂肪因子水平,并观察肝组织和脂肪组织中AMPK磷酸化水平、脂肪合成与分解关键酶、脂肪酸氧化酶及脂肪细胞因子等的变化。细胞实验包括以下四部分:1.3T3-L1前脂肪细胞:不同剂量荷叶碱干预细胞不同时间,观察3T3-L1前脂肪细胞的增殖在荷叶碱干预条件下的变化。同时将3T3-L1前脂肪细胞进行诱导分化,给予荷叶碱干预,分别在诱导分化早期（第3天）、中期（第6天）、晚期（第9天）,观察荷叶碱对分化过程中脂肪细胞内脂肪含量及脂肪细胞分化因子表达的影响。诱导分化为成熟的脂肪细胞后,不同浓度荷叶碱干预不同时间,观察荷叶碱对AMPK磷酸化、脂肪合成与分解及脂肪细胞因子表达的影响。使用AMPK特异性抑制剂对细胞进行预处理,观察荷叶碱上述作用是否因AMPK被抑制而发生逆转。另外,以含脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）启动子的荧光素酶报告基因质粒转染3T3-L1前脂肪细胞,观察荷叶碱干预对FAS启动子活性的影响。2.小鼠原代成熟脂肪细胞:自荷叶碱干预HFD饲喂小鼠的动物实验中分离培养各组小鼠附睾脂肪组织（eWAT）中成熟脂肪细胞,观察各组原代培养的小鼠成熟脂肪细胞中脂质含量的变化。3.来源于人内脏脂肪组织的脂肪间充质干细胞（Adipose-Derived Stem Cell,ADSC）:从单纯性肥胖患者内脏脂肪组织中分离并原代培养ADSC细胞,诱导分化为成熟脂肪细胞后,同样给予荷叶碱干预,观察荷叶碱对上述脂肪合成与分解及脂肪细胞因子表达的影响。同样使用AMPK特异性抑制剂预处理脂肪细胞细胞,观察荷叶碱的上述作用是否因AMPK被抑制而发生逆转。4.HepG2细胞:使用荷叶碱直接干预HepG2细胞或以0.4 mM棕榈酸（PA）干预构建脂肪肝细胞模型,再以荷叶碱分别干预细胞,观察荷叶碱对肝细胞内脂肪含量的影响及AMPK磷酸化、脂肪合成与分解酶、脂肪酸氧化酶及脂肪细胞因子表达的变化;同样使用AMPK特异性抑制剂对细胞进行预处理,观察荷叶碱的上述作用是否因AMPK被抑制而发生逆转。另外,分别以含FAS和激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase,HSL）启动子的荧光素酶报告基因质粒转染HepG2细胞,观察荷叶碱干预后HepG2细胞中FAS及HSL启动子活性的变化。[研究结果]动物实验结果如下:1.荷叶碱干预HFD饲喂小鼠方式与剂量的探索:第一部分实验中,Cont,Nuci-L（10mg/kg）,Nuci-M（20mg/kg）和 Nuci-H（30 mg/kg）组小鼠（每组n=3～4）以不同剂量荷叶碱羧甲基纤维素钠灌胃干预8周后,体重、摄食量、白色脂肪含量与肝脏重量均无明显差异。此外,荷叶碱干预IPGTT及IPITT试验各时间点血糖及血糖AUC均无明显影响。血清学糖脂代谢指标方面,Nuci-H组小鼠血清游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）水平较Cont 组小鼠升高 1.54 倍（1060.7±612.2 mmol/L vs.1628.6±642.8 mmol/L,P＜0.05）,其他指标无明显差异。第二部分实验中,Cont,Nuci-L（0.06%）,Nuci-M（0.12%）和 Nuci-H（0.24%）组小鼠（每组n=3）经饲料中添加不同剂量荷叶碱干预8周后,结果如下:Nuci-H组小鼠在干预2周后体重即较Cont组小鼠显著降低,此作用一直持续到实验结束。此外,Nuci-M和Nuci-L组分别在干预4周和5周后显著降低小鼠体重（P＜0.05）。与Cont组相比,三种剂量荷叶碱均能显著降低HFD饲喂小鼠白色脂肪总量（P＜0.05）。此外,Nuci-M组小鼠在IPGTT及IPITT试验60 min后均显著降低小鼠血糖（P＜0.05）,且其血糖AUC较Cont组小鼠有下降趋势。血清学糖脂代谢相关指标检测显示,Nuci-M组小鼠血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）水平有降低的趋势。此外,与Cont组相比,Nuci-L 及 Nuci-M 组小鼠空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）分别降低了 30.7%和29.2%（P＜0.05）,提示饲料添加0.12%及0.24%荷叶碱能够改善HFD饲喂小鼠血清糖脂代谢指标。值得注意的是,饲料添加不同剂量荷叶碱干预后小鼠血清谷草转氨酶（AST）水平随荷叶碱干预浓度升高而相应升高。与Cont组相比,Nuci-L,Nuci-M和Nuci-H组血清AST水平分别升高1.28倍,1.47倍和1.58倍（P＜0.05）,提示随着干预的药物浓度增加,荷叶碱可能对HFD饲喂小鼠肝脏具有一定的毒性作用,后续实验不宜选择过大剂量的荷叶碱进行干预。2.荷叶碱干预对HFD饲喂小鼠的作用根据上述探索实验,我们选择了饲料添加荷叶碱的方式对小鼠进行干预,本部分干预剂量介于上述实验的小剂量和中剂量之间（0.10%）。将C57BL/6J小鼠随机分为4组（每组n=12）,包括Litt,Cont,Nuci和Lira组,实验结果如下:（1）与HFD组相比,饲料添加0.10%荷叶碱干预在第一周就使小鼠体重显著下降,在干预12周后小鼠体重较对照组降低了 28.8%（P＜0.05）。类似地,HFD-Lira组小鼠在干预12周后体重也较HFD组显著下降（P＜0.05）。各组小鼠摄食量没有显著差异。荷叶碱使小鼠的白色脂肪含量显著降低73.8%（P＜0.05）,但对棕色脂肪组织（brown adipose tissue,BAT）或肝脏的重量无明显影响。（2）与HFD组相比,荷叶碱使血清TC、TG和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）水平分别降低了 10.6%、55.9%和 30.1%（P＜0.05）。此外,荷叶碱和利拉鲁肽均能显著降低HFD喂养小鼠FBG水平（P＜0.05）,同时有效改善小鼠的胰岛素敏感性,升高两种脂肪因子FGF21及ZAG的血清水平（P＜0.05）。各组之间的肝功能无明显变化。（3）代谢笼分析发现,荷叶碱显著提高了小鼠O2及CO2消耗。与HFD组相比,荷叶碱组小鼠在光照周期中能量消耗（energy expenditure,EE）升高1.41倍,在黑暗周期中则升高1.17倍（P＜0.05）,但其对呼吸交换率（respiratory exchange rate,RER）及小鼠运动情况无明显影响。（4）肝脏组织学水平上,荷叶碱和利拉鲁肽干预显著改善了 HFD诱导的肝脏脂肪变性（P＜0.05）。进一步机制研究发现,HFD喂养的小鼠肝脏中脂肪生成相关基因,包括固醇原件结合蛋白1（SREBP1）、FAS、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）mRNA表达显著升高,分别达到ND组的9.67倍、3.62倍和6.64倍（P＜0.05）,而荷叶碱和利拉鲁肽干预均能显著降低这些基因的mRNA水平（P＜0.05）。此外,荷叶碱还显著增加了肝脏中脂肪分解关键酶HSL、脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和脂肪酸氧化的关键酶PPARα、CPT1α的mRNA表达和脂肪细胞因子成纤维细胞生长因子2（FGF21）和锌α2糖蛋白（ZAG）mRNA的水平（P＜0.05）。肝脏组织水平蛋白印迹实验结果显示,荷叶碱组小鼠肝脏AMPK磷酸化水平升高至HFD组的3.38倍（P＜0.05）;（5）脂肪组织水平上荷叶碱干预能显著降低小鼠eWAT的重量,抑制脂肪组织中SREBP1、FAS、ACC mRNA的表达,促进HSL、ATGL、UCP1及脂肪细胞因子FGF21、ZAGmRNA的表达（P＜0.05）。脂肪组织水平蛋白印迹实验结果显示,荷叶碱干预能促进eWAT中AMPK的磷酸化,达到HFD组的2.55倍（P＜0.05）。细胞实验结果如下:1.3T3-L1前脂肪细胞:荷叶碱剂量及时间依赖性抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖（P＜0.05）。20 μM荷叶碱能够在前脂肪细胞分化的第3、第6和第9天显著降低细胞内脂质积累,同时使TG含量分别降低47.2%、59.9%和55.4%（P＜0.05）。此外,5～20μM荷叶碱干预能够使分化中的脂肪细胞内PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、FAS、ACC、HSL和ATGL的mRNA水平较对照组显著降低39.2～92.5%（P＜0.05）。20 μM荷叶碱干预完全分化的脂肪细胞后,与对照组（0μM）相比,FAS、ACC 和 SREBP1 mRNA 水平显著降低 22.6～45.2%（P＜0.05）,此外,荷叶碱还能够显著促进脂肪细胞因子FGF21及ZAG的表达（P＜0.05）。进一步的机制研究表明,2.5～20 μM荷叶碱显著降低了 3T3-L1前脂肪细胞中的FAS启动子的活性,在蛋白水平显著促进脂肪细胞中AMPK磷酸化。选择性AMPK抑制剂CC预处理后,荷叶碱降低脂肪累积及抑制脂肪合成、促进脂肪分解关键基因表达的作用被取消。2.小鼠原代成熟脂肪细胞:与HFD组相比,HFD-荷叶碱组小鼠eWAT原代培养的成熟脂肪细胞体积显著缩小,油红O染色结果发现,细胞内脂质含量显著降低（P＜0.05）。3.来源于人内脏脂肪组织的ADSC细胞:在完全分化的人原代ADSC细胞中,荷叶碱干预后,细胞内脂质含量显著降低,进一步机制研究发现,荷叶碱能够降低 FAS、ACC、SREBP1,同时升高 FGF21 和 ZAG mRNA 水平（P＜0.05）。与3T3-L1诱导分化的成熟脂肪细胞中得到的结果类似,荷叶碱显著促进人脂肪细胞中AMPK磷酸化,而AMPK选择性抑制剂CC预处理后,荷叶碱降低脂肪累积及抑制脂肪合成、促进脂肪分解关键基因表达的作用被取消。4.HepG2细胞:（1）0～20 μM的荷叶碱干预HepG2细胞48 h后,细胞的活力无明显改变;（2）随着荷叶碱浓度升高,细胞内脂质含量逐渐降低,与对照组相比,20 μM荷叶碱使脂质含量降低35.8%（P＜0.05）。同样,细胞内TG含量在荷叶碱干预后显著降低（P＜0.05）;（3）与在肝组织中获得的结果相似,20μM荷叶碱显著抑制SREBP1、FAS和ACC的表达,与对照组相比,各基因mRNA水平的表达量分别降低了 27.7%、27.0%和29.4%（P＜0.05）。同时,荷叶碱还能够促进脂肪分解和脂肪酸氧化的关键酶HSLATGL,PPARα和CPT1α的表达（P＜0.05）。此外,20μM荷叶碱分别使FGF21及ZAG表达水平增加到对照组的2.16倍和1.61倍（P＜0.05）;（4）进一步采用转染含有FAS或HSL启动子的荧光素酶报告基因质粒的方法,探讨了荷叶碱调节FAS和HSL表达可能的机制。结果发现,20 μM荷叶碱干预能显著降低转染FAS启动子质粒的荧光素酶的活性,与转染空白质粒的对照组相比,荧光素酶活性降低了 44.2%,同时能够显著促进转染HSL启动子质粒的荧光素酶的活性,达到对照组的1.39倍（P＜0.05）;（5）采用0.4mMPA诱导构建脂肪肝细胞模型,与预期的结果一致,油红O染色和TG含量测定发现PA能够显著升高细胞内脂质含量,显著降低HepG2细胞中AMPK磷酸化（P＜0.05）。而在10～20 μM荷叶碱干预后,上述现象被逆转。接下来,使用选择性AMPK抑制剂CC对细胞进行预处理。结果表明,CC取消了荷叶碱对AMPK磷酸化的促进作用。同样,CC预处理后20 μM荷叶碱诱导的脂肪合成减少、脂肪分解增加作用也被取消（P＜0.05）。[研究结论]1.荷叶碱具有预防HFD饲喂小鼠肥胖、减少脂肪含量、促进能量消耗、改善糖脂代谢的作用。2.荷叶碱能够改善HFD诱导的脂肪肝和脂肪组织扩张,机制可能和抑制脂肪细胞增殖分化,抑制细胞内脂肪合成,促进脂肪分解、促进脂肪酸氧化,同时促进脂肪细胞因子表达有关。3.荷叶碱通过激活AMPK信号通路发挥上述减少脂肪含量的作用。第二部分 荷叶碱对高脂膳食诱导或自发肥胖形成后的作用及其机制研究[研究目的]肥胖症流行趋势严峻。近年来,肠道菌群结构被认为对肥胖具有重大影响。荷叶碱是传统中药荷叶中一种主要的阿朴菲生物碱成分,我们前期研究发现,荷叶碱具有预防肥胖形成作用,但荷叶碱是否对已经形成的高脂膳食诱导肥胖（diet-inducedobesity,DIO）/自发肥胖具有减肥作用尚无文献报道。因此,本研究旨在通过荷叶碱对DIO小鼠及由于瘦素/瘦素受体突变导致自发肥胖的ob/ob及db/db小鼠进行干预,观察荷叶碱的减肥作用及其机制,并对ob/ob小鼠进行肠道菌群及类靶向代谢组学分析,探索可能的机制。[研究方法]动物实验如下:1.荷叶碱干预对DIO小鼠的作用:对8周龄雄性C57BL/6J小鼠分别给予普通饲料和45%高脂饲料喂养12周,构建饮食诱导肥胖（diet induced obesity,DIO）小鼠模型,然后分为以下三组（每组n=6）:普通饮食对照组（ND）,高脂膳食对照组（HFD）,高脂膳食荷叶碱组（HFD-Nuci）。其中高脂膳食荷叶碱组给予饲料添加0.10%荷叶碱,共干预6周。观察小鼠体质量、摄食、脂肪质量、糖脂代谢等的变化,进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）、IPGTT、IPITT和瘦素敏感性试验,同时检测肝脏及内脏脂肪组织脂肪合成与分解酶、脂肪酸氧化酶及脂肪细胞因子的表达。2.荷叶碱干预对ob/ob小鼠的作用:对7周龄雄性ob/ob小鼠给予普通对照饲料喂养,随机分为以下4组（n=7～9）:野生型对照组（Litt）,ob/ob对照组（Cont）,ob/ob荷叶碱干预组（Nuci）,ob/ob利拉鲁肽阳性对照组（Lira）。荷叶碱组饲料添加0.10%的荷叶碱,利拉鲁肽组进行每日利拉鲁肽皮下注射,剂量为200 μg/kg,干预8周。观察小鼠体质量、摄食、脂肪质量、糖脂代谢等的变化,检测血清中脂肪因子水平,并分别于肝组织和内脏脂肪组织中检测脂肪合成与分解酶、脂肪酸氧化酶及脂肪细胞因子的表达。取血清进行类靶向代谢组学分析,取盲肠内容物进行肠道菌群16S测序分析。3.荷叶碱干预对db/db小鼠的作用:对7周龄雄性db/db小鼠给予普通对照饲料喂养,随机分为以下3组（n=6～8）:野生型对照组（Litt）,db/db对照组（Cont）,db/db荷叶碱干预组（Nuci）。荷叶碱组饲料添加0.10%的荷叶碱干预8周。观察小鼠体质量、摄食、脂肪质量、糖脂代谢等的变化,并分别于肝组织和脂肪组织中检测脂肪合成与分解酶、脂肪酸氧化酶及脂肪细胞因子的表达。[研究结果]动物实验结果如下:1.荷叶碱饲喂对DIO小鼠的作用:荷叶碱干预后显著降低DIO小鼠体重增加量、抑制摄食量,同时降低肝脏重量、减少脂肪含量（P＜0.05）,同时减轻DIO小鼠肝细胞脂质累积,降低内脏脂肪细胞面积。OGTT发现,Nuci组小鼠血糖在30及60 min时均显著降低,血糖曲线下面积下降了 20.6%（P＜0.05）,且其敏感性优于IPGTT。荷叶碱干预对DIO小鼠瘦素敏感性无明显影响。同时,荷叶碱干预8周能够显著降低小鼠血清肝功能指标,降低DIO小鼠FBG及TC水平,升高血清HDL-C水平（P＜0.05）。进一步机制研究发现,荷叶碱能够在肝脏和内脏脂肪组织中显著降低SREBP1、FAS及另ACC mRNA水平,同时在脂肪组织中升高葡萄糖转运蛋白（GLUT4）及解耦连蛋白1（UCP1）mRNA的表达（P＜0.05）。2.荷叶碱饲喂对ob/ob小鼠作用:（1）与对照组相比,荷叶碱干预后显著降低ob/ob小鼠体重增加量,并使白色脂肪含量降低23.8%（P＜0.05）,同时显著改善ob/ob小鼠糖耐量及胰岛素敏感性。血清糖脂代谢指标测定发现,荷叶碱干预后能够显著改善肝功能,同时在脂代谢方面,荷叶碱使TC、TG及LDL-C水平分别降低 40.0%、38.0%和 58.9%（P＜0.05）,并使血糖降低 33.2%（P＜0.05）。（2）组织学水平,荷叶碱能够减轻ob/ob小鼠肝细胞脂质累积,降低内脏脂肪细胞面积。（3）肠道菌群16S测序结果显示,荷叶碱能够显著改变ob/ob小鼠肠道菌群结构,显著降低厚壁菌门与拟杆菌门的比值（Firmicutes/Bacteroidota ratio,2.12±0.48vs.1.10±0.25,P＜0.05）及放线菌门（Actinobacteriota）的相对丰度（2.39±0.91 vs.0.25±0.04,P＜0.05）,同时显著升高了疣微菌门（Verrucomicrobiota）的相对丰度。此外,在属水平,荷叶碱干预后使Akkermansia菌、Bacteroides菌、Blautia菌的丰度分别较Cont组显著升高了 40.9倍,2.95倍及3.58倍（P＜0.05）。同时,LachnospiraceaeNK4A136group 菌、Alistipe 菌、Helicobacter 菌及Colidextribacter菌丰度较Cont组小鼠显著下降了 68.7%,58.7%,67.3%及52.9%（P＜0.05）。（4）血清代谢组学结果提示,荷叶碱干预后ob/ob小鼠血清代谢物出现了显著改变,进一步差异代谢物KEGG信号通路富集分析显示,两组间差异代谢物主要涉及胰岛素抵抗、泛醌及其他类萜醌的生物合成、mTOR信号通路。（5）进一步在肝脏及脂肪组织中对胰岛素抵抗和mTOR信号通路上的靶基因mRNA水平进行验证。结果发现,荷叶碱干预后mTOR下游直接调节脂质生物合成的靶基因lipin1 mRNA水平的表达在肝脏和脂肪组织中分别显著降低了 88.5%和29.8%（P＜0.05）,同时肝脏GLUT2 mRNA表达下降,脂肪组织中GLUT4 mRNA水平表达升高,提示肝脏与脂肪组织胰岛素抵抗得到改善。3.荷叶碱饲喂对db/db小鼠作用:荷叶碱干预5周后显著降低db/db小鼠体重增加量、抑制摄食量（P＜0.05）,同时减轻db/db小鼠肝细胞脂质累积,降低内脏脂肪细胞面积。OGTT与IPITT试验发现,db/db小鼠葡萄糖耐量及胰岛素敏感性显著改善（P＜0.05）。此外,荷叶碱使db/db小鼠血清TG及FBG水平分别降低59.3%和24.4%（P＜0.05）,但对TC或LDL-C水平并无明显影响。进一步机制研究发现,荷叶碱能够在肝脏和内脏脂肪组织中显著降低SREBP1、FAS及另ACC mRNA水平（P＜0.05）,在肝脏抑制葡萄糖6磷酸酶（G6Pase）、同时在脂肪组织中升高UCP1 mRNA水平的表达（P＜0.05）。[研究结论]1.荷叶碱对不同肥胖模型小鼠,包括DIO、ob/ob及db/db小鼠均具有减肥、减少脂质含量,改善糖脂代谢的作用。2.荷叶碱能够在肥胖模型小鼠肝脏与脂肪组织中通过抑制脂肪合成、调节葡萄糖转运发挥减肥、改善胰岛素敏感性作用。3.荷叶碱可能通过调节肠道菌群结构及胰岛素抵抗和mTOR信号通路发挥上述有益作用。