【摘 要】
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研究目的:R-spondin3（RSPO3）在血管发育和血管生成中发挥重要作用。近期研究证实RSPO3可激活Akt-mTOR通路,但具体分子机制有待明确。已知G蛋白抑制性α亚单位（Gαi蛋白）在生长因子刺激下作为关键信号蛋白介导下游Akt-mTOR等通路活化。本论文关注了 Gαi1和Gαi3蛋白在RSPO3信号及促血管生成中的作用。研究方法:多个基因手段（shRNA、CRISPR/Cas9、显性负
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研究目的:R-spondin3（RSPO3）在血管发育和血管生成中发挥重要作用。近期研究证实RSPO3可激活Akt-mTOR通路,但具体分子机制有待明确。已知G蛋白抑制性α亚单位（Gαi蛋白）在生长因子刺激下作为关键信号蛋白介导下游Akt-mTOR等通路活化。本论文关注了 Gαi1和Gαi3蛋白在RSPO3信号及促血管生成中的作用。研究方法:多个基因手段（shRNA、CRISPR/Cas9、显性负性遗传、过表达等）正向或负向调节小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）内Gαi1/3蛋白的表达/活化水平,检测RSPO3诱导的Akt-mTOR信号通路以及接头蛋白Gab 1活化。在Gαi1/3敲减的内皮细胞（HUVECs和HCMEC/D3）中,使用Transwell、Matrigel（基质胶）Transwell、EdU（2’-脱氧-5-乙炔尿苷）实验和成管实验等方法检测Gαi1/3在RSPO3介导的血管生成中的作用。运用玻璃体腔内注射带Tie1启动子慢病毒载体,观察内皮细胞特异性敲减Gαi1/3后对RSPO3促视网膜血管生成的作用。研究结果:小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中,Gαi1和Gαi3双敲除（DKO）阻断了 RSPO3诱导的Akt-mTOR信号通路活化;通过CRISPR/Cas9基因编辑敲除Gαi1和Gαi3的表达同样显著抑制了 RSPO3诱导的Akt-mTOR的活化;Gαi1或Gαi3单敲除部分抑制RSPO3诱导的Akt-mTOR信号活化;而Gαi2单敲除对RSPO3诱导的Akt-mTOR信号活化无显著影响;shRNA敲减Gαi1/3或利用显性负性遗传使Gαi1/3突变抑制RSPO3诱导的Akt-mTOR的活化;在Gαi1/3双敲除的MEFs中外源性的导入Gαi1或Gαi3,部分拯救RSPO3诱导的Akt-mTOR的活化;Gαi1/3的过表达增强了 RSPO3诱导的Akt-mTOR的活化。RSPO3处理后,Gαi1/3介导的Akt通路活化独立于Wnt/β-catenin信号,但需要适配体蛋白Gab1。在HUVEC和HCMEC/D3血管内皮细胞中,Gαi1/3的敲减抑制了RSPO3诱导的Akt-mTOR信号活化及细胞迁移、侵袭、增殖和体外成管。导入持续活化的Akt1质粒挽救Gαi1/3敲减细胞中RSPO3体外促血管作用。在体实验表明内皮细胞特异性敲减Gαi1/3后显著抑制RSPO3过表达诱导的小鼠的视网膜血管生成。研究结论:Gαi1/3是RSPO3介导的下游Akt-mTOR信号活化的关键信号蛋白。Gαi1/3参与RSPO3诱导的血管内皮细胞增殖、迁移、侵袭和成管。内皮细胞特异性敲减Gαi1/3抑制RSPO3过表达诱导的小鼠的视网膜血管生成。
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