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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是由镰孢菌属产生的一种非甾类,具有类雌激素活性的真菌毒素。目前,全世界多数国家的农作物中均检出有ZEA的污染。我国多数地区的温度和相对湿度比较适宜霉菌的生长,因此很多农作物及其饲料产品受ZEA的污染严重。大量的研究已经证实,ZEA可以造成生殖器官的形态改变以及功能紊乱、退化。妊娠期的动物食用含ZEA的食物可引起流产、死胎和畸胎。目前,关于ZEA的生殖毒性研究,主要集中在ZEA对卵巢颗粒细胞和卵母细胞的影响。而关于ZEA对子宫功能影响的研究较少,尚未见ZEA对体外培养的子宫内膜基质细胞,的毒性作用及机制的研究报道。因此,本试验首先分析体内注射ZEA对青春期小鼠的毒性作用,并初步探讨ZEA对体外培养的小鼠子宫内膜基质细胞的毒性作用及其分子机制,在此基础上,通过RNA-seq测序筛选与ZEA引发的小鼠子宫内膜基质细胞功能衰退相关的关键基因,为进一步揭示ZEA对小鼠子宫内膜基质细胞毒性作用的分子机制奠定基础。本研究的主要内容及结果如下:1、ZEA对青春期雌性小鼠的毒性作用本试验通过腹腔注射不同剂量(0mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg和1mg/kg ZEA BW)的ZEA,研究其对青春期小鼠的毒性作用。连续4周注射ZEA后,0.5mg/kgZEABW和1mg/kgZEABW处理组小鼠体重较对照组显著降低(P<0.05)。1mg/kgZEABW处理组小鼠的脾脏指数和子宫指数显著升高(P<0.05)。在肝脏中,1mg/kgZEABW处理组的SOD和CAT基因的mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05);在肾脏中,0.5mg/kg ZEABW和1mg/kg ZEA BW处理组的SOD基因的表达量均显著低于对照组(P<0.05)。在子宫中,1mg/kg ZEABW处理组的Bax/Bcl-2比率显著高于对照组(P<0.05 );在卵巢中,与对照组相比Bax和Caspase-3的mRNA表达量以及Bax/Bcl-2的比率均显著升高(P<0.05)。在子宫中,1mg/kgZEABW处理组ERα基因的表达量显著低于对照组(P<0.05)。随着ZEA注射剂量增加,小鼠的发情周期出现紊乱,0.5mg/kgZEABW处理组的发情期延长,1mg/kgZEABW处理组的发情期更长,并且多数小鼠直接跳过发情前期进入发情期。各组之间的见栓率差异不大,平均约为68.75%。受孕率差异比较大,1mg/kgZEABW处理组的受孕率最低(45.45%),与对照组(81.82%)相比降低了约 36.37%。0.5mg/kgZEABW 和 1mg/kgZEABW 处理组的小鼠平均产仔数显著低于对照组(P<0.01)。研究结果表明,ZEA严重影响小鼠的生长发育,造成主要脏器和生殖器官损伤,影响氧化应激、细胞凋亡和类固醇激素受体等相关基因的表达,造成发情周期紊乱以及繁殖力的降低。2、ZEA对小鼠子宫内膜基质细胞的毒性作用本研究采用细胞计数法、CCK-8细胞活力检测法、流式细胞仪分析法以及TUNEL法等,研究ZEA对体外培养的小鼠子宫内膜基质细胞的毒性作用。体外培养4～5d,小鼠子宫内膜基质细胞总数及活力达到峰值,随后下降。ZEA处理浓度和时间对小鼠子宫内膜基质细胞的活力有显著影响(P<0.05)。ZEA浓度为100μM时,细胞开始皱缩,但细胞漂浮较少。ZEA浓度为150μM时,细胞皱缩严重,并大量漂浮。随着ZEA浓度增加,与对照组相比,S期的比例显著下降(P<0.05),G2/M期显著增加(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。研究结果表明,ZEA能够引起体外培养的小鼠子宫内膜基质细胞皱缩与漂浮,造成G2/M的阻滞以及细胞内DNA复制受阻,引起细胞凋亡。3、ZEA对小鼠子宫内膜基质细胞的毒性作用的机制研究采用qRT-PCR、Western Blot、酶活性检测、CCK-8活力检测和流式细胞仪分析等方法,分析ZEA对小鼠子宫内膜基质细胞的毒性作用机制。随着ZEA处理浓度的增加,p53、Gadd45α、Bax以及Caspase-3和Caspase-9蛋白的mRNA表达量极显著升高(P<0.05), CCNB1、cdc2、Bcl-2基因的表达量显著降低(P<0.05),Bax/Bcl-2的比率极显著升高(P<0.01)。Bax/Bcl-2的蛋白比率,Caspase-3和Caspase-9蛋白的酶活性显著升高(P<0.05)。ROS水平极显著升高(P<0.01),线粒体膜电位极显著下降(P<0.01)。与100μM ZEA相比,添加抑制剂后的细胞凋亡率极显著降低(P<0.01),细胞活力极显著升高(P<0.01)。试验结果表明,ZEA通过改变p53、Gadd45α、CCNB1和cdc2基因的表达量,引起小鼠子宫内膜基质细胞的G2/M期阻滞,ZEA通过改变线粒体凋亡途径相关基因Bax和Bcl-2以及Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量,引起小鼠子宫内膜基质细胞发生细胞凋亡。4、ZEA处理的小鼠子宫内膜基质细胞的转录组特征本试验利用RNA-seq测序技术对ZEA处理的小鼠子宫内膜基质细胞进行转录组测序分析,测序结果显示ZEA处理组相比于对照组共有3846个差异表达的基因,其中上调1810个基因,下调2036个基因;对差异表达基因进行GO功能富集分析以及KEGG pathway功能富集分析,结果表明这些差异表达基因参与的GO term和KEGG pathway中多数参与了胚胎植入以及妊娠建立等过程。同时,通过对ZEA处理组和对照组的测序序列组装与定位,发现在对照组中共获得48778242条高质量测序序列,且有39527611 (81.04%)条序列可被比对到小鼠的参考基因上;存在34264个可变剪接形式,1591个基因结构得到优化以及发现275个新转录本。在ZEA处理组中共获得489614822条高质量测序序列,且有40768991 (83.27%)条序列可被比对到小鼠的参考基因上;存在41584个可变剪接形式,1646个基因结构得到优化以及发现319个新转录本。需要进一步验证这些差异是否与ZEA引起的小鼠子宫内膜基质细胞功能变化相关。