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辣椒是我国重要的园艺作物,种植面积达150万~160万公顷,约占全国蔬菜种植总面积的10%。辣椒病毒病是危害辣椒生产的重要病害,目前世界上已发现近40种病毒可以侵染辣椒。辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员,可侵染不同品种的辣椒,主要引起叶片皱缩、花叶和果实扁平、变小、畸形等症状,对辣椒的生产造成了严重损失。本文对PMMoV与寄主之间的互作关系进行了深入研究,探索了vsiRNA、miRNA和相关寄主因子在PMMoV与辣椒互作中的功能,并揭示了PMMoV侵染诱导的细胞自噬是寄主抗病毒的重要机制之一,主要研究结果如下:本文针对侵染辣椒的两种病毒PMMoV和辣椒脉斑驳病毒(chilli venial mottle virus,ChiVMV)建立了一种快速RT-RPA检测技术。该技术仅需一对特异性引物,在38℃条件下反应30 min即可完成扩增;具有良好的特异性,检测过程中与其他相关病毒无交叉反应;检测灵敏度是普通RT-PCR技术的10倍;可用于田间样品快速检测。本文通过高通量测序研究了PMMoV侵染辣椒后vsiRNA的表达特征,探索了小RNA在病毒与寄主互作中的重要功能。PMMoV侵染后辣椒中vsiRNA的长度主要是21-nt和22-nt,5’末端碱基以U为主,vsiRNA来源于PMMoV基因组的正负链,但其在正负链上分布却表现出明显的不均匀分布,来源于PMMoV正链的vsiRNA及热点(hotspot)比来源于负链的多,并且在RdRp编码区和CP编码区位置热点数较其他区域多。对vsiRNA的靶标预测表明42个特异的vsiRNA靶向辣椒中的66个注释基因,并且在特定条件下,正义链中的大多数vsiRNA有多个靶点,而反义的大多数vsiRNA只有一个靶点。对这些靶标进行Gene Ontology(GO)分析,结果表明许多注释的靶标参与了应激反应、细胞调节和新陈代谢相关的生理途径。另外,PMMoV侵染能显著诱导辣椒中CaAGO1a/1b/2,CaDCL2和CaRDR1的表达。进一步分析测序结果表明,PMMoV侵染影响了辣椒中内源小RNA的表达。本研究共鉴定到88个辣椒中已知miRNA,其中包括20个辣椒中特异的miRNA,并预测得到198个新miRNA。利用生物信息学软件预测了miRNA的靶标,并进行功能分析,GO分析显示大部分靶标在辣椒生长发育和防御信号过程中发挥重要作用,这些结果为研究病毒侵染对辣椒miRNA调控网络的影响奠定了基础。为了进一步了解辣椒与PMMoV的互作情况,本研究借助高通量测序技术从转录水平上对未感染PMMoV和感染PMMoV的辣椒植株进行了基因表达分析。共获得24,227个基因,得到了197个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),其中172个基因较对照组显著上调,25个基因显著下调,这些DEGs参与了病毒侵染后辣椒中信号通路的差异调节以及防御相关因子的表达。对这些DEGs进行GO和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome(KEGG)通路富集进一步分析,分别得到53条显著富集的GO terms和6条显著富集的KEGG途径。另外,通过鉴定明确了PMMoV侵染影响多个辣椒细胞自噬相关基因(autophagy-related genes,ATGs)的表达,暗示细胞自噬可能在PMMoV侵染过程中发挥重要功能。自噬与植物病毒之间的直接相互作用成为最近研究的热点。在本研究中,以模式植物本氏烟为材料,利用透射电子显微镜观察、自噬marker GFP-ATG8a荧光和免疫印迹观察以及实时荧光定量PCR分别检测PMMoV侵染后烟草叶片细胞内自噬结构的形成和细胞自噬相关基因NbVPS15、NbATG3、NbATG5、NbBeclin1、NbATG7、NbATG8a、NbATG9的表达特征,明确了PMMoV侵染能够诱导寄主的细胞自噬反应。利用VIGS技术分别沉默NbATG3、NbATG5、NbBeclin1、NbATG7和NbATG8a等几个自噬关键基因,可增加PMMoV的积累并加快症状的产生,与此同时,使用细胞自噬抑制剂3-MA和E64d处理也会增加病毒的积累。酵母双杂交结果显示,PMMoV编码的P126能够与NbATG8f互作,其中解旋酶区域Hel是互作的关键结构域,暗示P126可能通过与NbATG8f结合而成为自噬降解的靶点。这些结果进一步表明自噬在PMMoV侵染过程中发挥抗病毒作用。