在心脏发育过程中，心肌细胞增殖对心室壁形态发生和心肌致密化过程起到了关键作用，心肌细胞增殖异常与心肌致密化不全的发生密切相关。有机氯农药五氯硝基苯(Pentachloronitrobenzene，PCNB)是一种农业生产中广泛使用的土地杀菌剂，在生态系统中具有较强的生物富集性，给农作物生产和食品安全带来了严重的隐患。本研究基于前期工作基础进一步探究了PCNB影响心肌细胞增殖以及诱导心脏发育毒性的机制。
　　我们对E8.5天的孕鼠(C57BL/6N)分别进行玉米油和PCNB连续灌胃给药，对E14.5和E17.5胎鼠心脏组织进行病理学检测。HE染色结果显示PCNB处理没有引起明显的心脏发育结构缺损，而对心室小梁区和心肌致密层区域厚度进行测定发现，PCNB孕期暴露引起胎鼠心脏组织左右心室过度小梁化，致密层区变薄，心室非致密化比例显著升高，表现出心室致密化不全样病理表型。为了探究PCNB引起心肌致密化不全的可能机制，我们对心脏组织及心肌细胞的增殖和凋亡情况进行检测。免疫荧光染色检测结果显示PCNB处理引起胎鼠心室壁致密层区心肌细胞周期标志物Ki67和有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3(pH3)水平降低，TUNEL染色结果显示PCNB处理没有诱导明显的胎鼠心肌细胞凋亡，表明PCNB主要诱导胎鼠心肌细胞有丝分裂异常，抑制增殖。进一步我们利用体外心肌细胞探究了PCNB的毒性效应，分别用不同浓度PCNB处理大鼠心肌细胞H9c2，EdU染色发现PCNB剂量依赖性抑制心肌细胞增殖，pH3免疫荧光染色显示PCNB抑制体外心肌细胞有丝分裂，而流式检测表明PCNB没有诱导细胞发生明显的凋亡现象。这些结果表明PCNB可能通过诱导胎鼠心肌细胞有丝分裂异常，抑制细胞增殖活性而引起心室致密化不全。
　　为了探索PCNB诱导心室致密化不全表型的分子机制，对照组和PCNB处理组E17.5胎鼠心脏组织进行RNA-seq分析，结果显示PCNB处理导致心脏组织内97个基因上调，92个基因下调。GO分析结果表明差异表达基因主要与细胞有丝分裂、染色体分离以及动粒和微管结合相关。差异表达基因互作网络分析表明动粒核心组分(包括NDC80复合物成员Hec1、Nuf2、Spc25)以及动粒微管互作调控因子位于差异表达基因互作网络的中心位置，候选基因RT-PCR分析也验证转录组测序结果。作为有丝分裂过程的核心事件，染色体的正确排列与分离由动粒和纺锤体微管的动态相互作用协调实现，其中Hec1构成动粒上核心的微管结合位点，在染色体分离中发挥核心作用。我们初步候选Hec1作为PCNB作用的关键靶分子进行进一步探究。免疫组化检测结果显示Hec1在胎鼠心脏组织内整体均有分布，在心肌细胞增殖活性较高的心室壁致密层区高表达。PCNB处理下调心脏组织内Hec1的mRNA和蛋白水平。对心脏组织切片HE染色进行观测发现PCNB处理引起细胞核型异常比例显著增加，对纺锤体标志物β-tubulin免疫荧光染色发现PCNB引起心脏组织内细胞有丝分裂过程纺锤体形态和染色体分离异常。体外心肌细胞实验结果表明，PCNB处理下调Hec1的表达，诱导心肌细胞纺锤体的形态和染色体排列、分离异常，干扰细胞有丝分裂，抑制细胞增殖活性。细胞免疫荧光染色结果显示，心肌细胞内源性Hec1主要表达分布于有丝分裂期细胞动粒内。利用siRNA敲低Hec1抑制心肌细胞增殖和有丝分裂，导致单极和多极纺锤体比例显著增加，而正常的双极纺锤体比例明显降低，加剧了PCNB对心肌细胞增殖和有丝分裂的抑制作用，心肌细胞内过表达Hec1能够显著抑制PCNB引起的心肌细胞纺锤体形态异常以及细胞增殖和有丝分裂活性的降低。这些研究结果提示PCNB抑制心肌细胞增殖和有丝分裂可能因为下调Hec1的表达，影响动粒与纺锤体微管的相互结合。
　　本研究结果表明PCNB暴露抑制心肌细胞增殖，引起胎鼠心肌致密化不全样表型，其作用机制可能与PCNB下调NDC80复合物组分Hec1等动粒相关蛋白的表达，诱导心肌细胞有丝分裂过程纺锤体形态和染色体分离异常，导致有丝分裂阻滞有关。