第一部分结直肠锯齿状腺癌KRAS/NRAS/BRAF突变与预后分析　　目的:　　分析中国人结直肠锯齿状腺癌的临床病理学特征和KRAS/NRAS/BRAF突变及相关预后因素，为临床提供有用的预后预测信息，为肿瘤的治疗和干预提供理论依据。　　方法:　　对2005年-2011年间在浙江大学医学院附属第二医院接受手术治疗的结直肠癌患者的病理切片进行复查，根据2010年WHO结直肠肿瘤分类标准对病理切片进行再诊断和重新分类。选用其中诊断结果为锯齿状腺癌的病例85例、普通型高-中分化腺癌115例和腺瘤36例的手术标本蜡块，采用荧光PCR法进行KRAS/NRAS/BRAF基因突变检测。对腺癌组织标本进行免疫组化染色，分析5个标志物（SOX2，MSH2，P53，CD44和MAPK）在不同组织学类型腺癌中的表达水平差异，分析标志物的表达水平与KRAS/NRAS/BRAF基因突变的关系。对所有肠癌病例进行随访，分析锯齿状腺癌与高-中分化腺癌的预后差异，分析不同KRAS/NRAS/BRAF基因状态下的肿瘤预后差异，用多因素COX回归筛选锯齿状腺癌独立的预后标志物。　　结果:　　锯齿状腺癌占全部腺癌的比例为14.1％，患者的平均年龄63.84岁，肿瘤平均直径为4.03cm。高-中分化腺癌与锯齿状腺癌在淋巴结转移(x2=19.382，P＜0.001)、pTNM分期(x2=4.720，P=0.030)、3年生存期(x2=9.898，P=0.002)和5年生存期(x2=14.287，P＜0.001)之间存在显著性差异。　　KRAS/NRAS/BRAF总体突变率在腺瘤中为72.2％，高于腺癌组织52.5％(x2=4.805，P=0.028)。KRAS外显子2的突变率最高，在腺瘤和腺癌中分别61.1％和42.5％，差异有统计学意义(x2=4.264，P=0.039)。而KRAS外显子3、外显子4、NRAS外显子2、外显子3和BRAF外显子15在腺瘤和腺癌中的突变水平无统计学差异。在腺瘤和腺癌中均未检测到NRAS外显子4突变。有3例腺瘤和1例腺癌存在2个KRAS突变位点。　　在腺癌中KRAS突变与患者性别和肿瘤体积有关，女性高于男性(x2=7.572，P=0.006)，直径大于3cm的肿瘤突变率高于直径小于等于3cm的肿瘤(x2=4.854，P=0.028)。BRAF基因突变与肿瘤的部位和组织学类型有关。其中，右半结肠4例，直肠2例，而左半结肠未检测到BRAF突变(x2=6.324，P=0.042)。全部6例BRAF突变都发生在锯齿状腺癌，而中-高分化腺癌未检出BRAF基因突变(x2=6.119，P=0.013)。KRAS/NRAS/BRAF基因总体突变水平与患者性别、肿瘤体积、组织学类型和5年生存期有关。女性高于男性(x2=7.336，P=0.007)，直径大于3cm的肿瘤高于直径小于等于3cm的肿瘤(x2=4.037，P=0.045)，锯齿状腺癌高于高-中分化腺癌(x2=8.832，P=0.003)，五年内死亡的患者高于五年内生存的患者(x2=7.422，P=0.006)。　　所有5个标志物（SOX2，MSH2，P53，CD44和MAPK）的表达水平均与组织学类型无明显相关性。在锯齿状腺癌中，MAPK的表达与肿瘤的大体类型和pTNM分期有关，隆起型高于溃疡型和浸润型(x2=6.864，P=0.033)，Ⅰ-Ⅱ期肠癌高于Ⅲ-Ⅳ期(x2=5.207，P=0.022)。SOX2和CD44的表达水平与KRAS/NRAS/BRAF的突变水平有关。SOX2阳性表达的7个病例全部发生KRAS/NRAS/BRAF突变，而阴性表达中有50.4％发生KRAS/NRAS/BRAF基因突变，差异有统计学意义(x2=6.556，P=0.010)。CD44阳性表达的肠癌KRAS/NRAS/BRAF基因突变率(59.2％)高于阴性表达的肠癌(40.5％)，差异有统计学意义(x2=3.829，P=0.050)。　　采用Kaplan-Meier法对肠癌患者进行生存分析发现，锯齿状腺癌的预后水平比高-中分化腺癌差(x2=13.231，P＜0.001)。KRAS/NRAS/BRAF基因突变的肠癌患者比野生型患者的预后水平差(x2=13.231，P＜0.001)。BRAF基因突变的患者预后比野生型差，但未检出统计学差异(x2=2.992，P=0.084)。　　对200例肠癌根据组织学类型和KRAS/NRAS/BRAF基因突变水平进行分型，分为高-中分化腺癌野生型、高-中分化腺癌突变型、锯齿状腺癌野生型和锯齿状腺癌突变型。结果发现锯齿状腺癌伴有基因突变组的预后最差。而其它三组（普通型高-中分化腺癌伴KRAS/NRAS/BRAF基因突变、普通型高-中分化腺癌野生型、锯齿状腺癌野生型）之间预后水平无显著差别。　　对85例结直肠锯齿状腺癌采用多因素COX比例风险模型进行生存分析，结果发现，pTNM分期（P=0.015，HR=20.508，95％CI:1.796-234.151）、KRAS基因突变(P=0.026，HR=3.035，95％CI:1.14-8.076)、NRAS基因突变(P=0.001，HR=24.792，95％CI:3.792-155.447)和BRAF基因突变(P=0.04，HR=7.319，95％CI:1.092-49.062)是锯齿状腺癌独立的预后因素。　　结论:　　腺瘤KRAS/NRAS/BRAF总突变率高于腺癌，锯齿状腺癌KRAS/NRAS/BRAF总突变率高于高-中分化腺癌;BRAF在锯齿状腺癌和高-中分化腺癌中的突变水平不同;中国人结直肠癌BRAF基因突变率低于欧美国家患者;与高-中分化腺癌相比，锯齿状腺癌更容易发生淋巴结转移，具有更高的TNM分期，较低的3年和5年生存期;伴有KRAS/NRAS/BRAF基因突变的锯齿状腺癌预后比野生型差;pTNM分期和KRAS/NRAS/BRAF基因状态可作为预测锯齿状腺癌预后水平的独立预测指标。　　第二部分结直肠癌预后预测模型　　目的:　　分析预后相关标志物在结直肠癌中的表达水平与临床病理指标及预后之间的关系，寻找最佳的标志物组合，建立一个稳定的结直肠癌预后预测模型。　　方法:　　收集2001年至2011年间在浙江大学医学院附属第二医院接受手术治疗的结直肠癌患者的临床病理学资料，共计1164例。对全部病例进行随访。把相应的手术标本蜡块制成组织芯片进行免疫组化染色。对15个标志物(Lgr5，CA4，ANKRD12, PEDF, E-Cad, FOXE1, AZGP1, SOX2, MSH2, P53, CD44, SPARCL1,ADCY2，SHP2和MAPK）的染色结果进行显微镜下判断。根据判读结果，分析标志物的表达水平与临床病理指标的关系。分析标志物和临床病理学指标与肠癌预后的关系。用Logistic回归建立预测肠癌患者5年生存率的预后预测模型。　　结果:　　共制备35个组织芯片，共包含1164个肿瘤组织和954个肿瘤旁组织位点。经HE染色和免疫组染色发现，肿瘤和肿瘤旁粘膜组织均存在组织缺失或无效样本。肿瘤旁粘膜的有效样本量远远低于肿瘤组织。　　15个标志物在结直肠癌中的表达水平不同，表达率最低的是SOX2仅为7.13％，表达水平最高的是ADCY2，为93.13％。15个标志物中有14个在肿瘤组织和肿瘤旁粘膜组织中的表达水平存在差异。15个标志物表达水平分别与性别、年龄、肿瘤体积、部位、组织学类型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和pTNM分期有不同程度的相关性。　　Lgr5的表达与肿瘤部位、肿瘤体积、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及pTNM分期相关。CA4的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和pTNM分期相关。ANKRD12的表达与淋巴结转移相关。PEDF的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和pTNM分期相关。E-Cad的表达与肿瘤的组织学类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移和pTNM分期相关。FOXE1与肿瘤体积、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和pTNM分期相关。AZGP1的表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移和pTNM分期相关。SOX2的表达与患者年龄、肿瘤体积、分化程度、浸润深度、淋巴结转移和远处转移相关。MSH2的表达与患者年龄和肿瘤部位相关。P53的表达与全部的临床病理指标无明显相关性。CD44的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移和pTNM分期相关。SPARCL1的表达与肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移、远处转移和pTNM分期相关。ADCY2与患者性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移和pTNM分期相关。SHP2的表达与肿瘤淋巴结转移和pTNM分期相关。MAPK的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和pTNM分期相关。　　单因素分析显示，年龄、组织学类型、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、是否远处转移、pTNM分期以及标志物Lgr5，CA4，ARKND12，PEDF, E-Cad，FOXE1，AZGP1，SOX2，MSH2，CD44，SPARCL1，ADCY2，SHP2，MAPK的表达水平均与肿瘤患者的预后有关。而多因素分析显示，年龄、肿瘤组织学类型、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、AZGP1，E-Cad，FOXE1，MAPK和SOX2是肠癌患者的独立预后指标。　　采用临床病理指标（包括年龄、肿瘤组织学类型、浸润深度、淋巴结转移和远处转移）建立的结直肠癌五年生存预后预测模型效果优于单纯采用标志物(Lgr5，E-CAD，FOXE1，AZGP1，SOX2)建立的预后预测模型。联合临床病理学指标和标志物(年龄、肿瘤组织学类型、浸润深度、淋巴结转移和远处转移，E-Cad，FOXE1，AZGP1，SOX2)建立的五年预后预测模型的预测效果得到提高(AUC=0.863，P＜0.001,95％CI:0.820-0.905)。　　结论:　　采用标志物可以建立结直肠癌预后预测模型。单纯采用标志物建立的模型预测效果弱于临床病理学指标。联合应用临床病理学指标和标志物对结直肠癌5年生存率进行预测可以取得更为理想的评价效果。