三种抗氧化剂对典型真菌毒素诱导的凡纳滨对虾肌肉品质劣化的保护机理

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黄曲霉毒素B1(AFB1)、T-2毒素、赭曲霉毒素(OTA)和呕吐毒素(DON)是普遍存在水产饲料中的典型强毒性真菌毒素,易在凡纳滨对虾体内蓄积并引发氧化应激反应诱导其肌肉品质下降,但现有研究难以揭示真菌毒素诱导虾肉品质下降的根本原因。槲皮素、芦丁和茶多酚是具有强抗氧化和抗炎作用的绿色抗氧化剂,已广泛应用于防控对虾生长特性降低和消化道损伤等不利影响,但其对虾肉品质变化的保护作用未见报道。鉴于此,本研究采用四种真菌毒素(AFB1、T-2、OTA、DON)和三种抗氧化剂(槲皮素、芦丁、茶多酚)经20 d定期剂量递增法同步暴露凡纳滨对虾,从肌肉组织损伤、基础营养成分、氨基酸和脂肪组成、蛋白质变性及其组成等角度分析真菌毒素对对虾肌肉品质的影响及抗氧化剂的保护作用,并通过非标记定量蛋白质组学筛选与真菌毒素和抗氧化剂显著相关联的差异指示蛋白,从分子水平上解析真菌毒素诱导对虾肌肉品质下降和抗氧化剂保护作用的根本原因。主要研究结果和结论如下:(1)四种毒素暴露导致对虾肌肉显微结构损伤,致使虾肉外观品质和加工品质下降,如肌肉肌纤维间隙显著扩大、肌节断裂、炎症现象等,且存在剂量依赖性。三种抗氧化剂在试验前中期(4-12 d)对对虾肌肉相关损伤有显著缓解作用,但在后期(16-20 d)不明显,说明0.20-0.08%槲皮素、0.30-1.20%芦丁、0.04-0.16%茶多酚对四种毒素引起肌肉显微结构损伤具有保护作用,这与抗氧化剂具有保护细胞完整性的作用密切相关。(2)四种毒素暴露能引发对虾机体氧化应激反应,致使其肌肉各类营养成分过度氧化而导致虾肉营养品质下降。经四种毒素暴露20 d后,对虾肌肉基础营养成分含量(水分、粗脂肪和粗蛋白)降低7.61-9.22%,必需氨基酸含量显著降低(P<0.05)且其指数下降8.14-10.71%,多不饱和脂肪酸总量降低16.63-18.40%。在试验前中期(4-12 d),槲皮素、芦丁和茶多酚清除自由基的抗氧化作用能有效减弱对虾机体的氧化应激反应,说明抗氧化剂对四种毒素暴露引起的虾肉各类营养成分含量降低有抑制作用,且槲皮素的保护作用更显著,添加槲皮素组对虾必需氨基酸和不饱和脂肪酸含量均接近于空白对照组。(3)四种毒素暴露均能诱导对虾肌肉蛋白质严重变性,导致虾肉营养品质下降。经四种毒素暴露20 d后,对虾肌动球蛋白盐溶性、Ca2+-ATPase活性、巯基含量和ATP感度显著降低(P<0.05),表面疏水性显著增高(P<0.05),其中Ca2+-ATPase活性、巯基含量和表面疏水性与毒素暴露剂量显著相关(R2=0.86-0.99),可作为真菌毒素诱导对虾肌肉蛋白质变性的潜在评价指标。槲皮素和芦丁对四种毒素引起的对虾蛋白生化特性变化具有明显的减弱和抑制作用,各指标在试验前中期(4-12 d)接近空白对照组,但茶多酚总体作用较弱,茶多酚对T-2和DON引起的Ca2+-ATPase活性和巯基含量降低无明显作用。(4)真菌毒素暴露能引起对虾机体基因和细胞毒性效应,抑制DNA和RNA合成,进而影响其蛋白质组成。从试验中期(12 d)角度看,四种毒素暴露诱导对虾肌肉中肌浆蛋白、肌基质蛋白和肌原纤维蛋白含量显著降低(P<0.05),碱溶性蛋白含量显著增高(P<0.05)。槲皮素、芦丁和茶多酚在试验中期对不同毒素引起的对虾肌肉蛋白质组成变化均有明显抑制作用,与单独毒素组相比,抗氧化剂实验组对虾肌浆蛋白、肌基质蛋白和肌原纤维蛋白含量的升高幅度在14.04-37.16%之间。采用SDS-PAGE筛选出差异蛋白条带,再利用LC-MS/MS技术鉴定差异蛋白点,发现与四种毒素(AFB1、T-2、OTA和DON)和三种抗氧化剂相关联的目标蛋白数量分别为11、10、8和11个,其中催化机体能量代谢的果糖二磷酸醛缩酶(FBA)和精氨酸激酶(AK)以及调控蛋白质翻译的翻译起始因子(EIF)的表达水平与毒素和抗氧化剂均显著相关,可作为典型真菌毒素诱导对虾肌肉品质下降和抗氧化剂保护作用的差异指示蛋白。综上所述,AFB1、T-2、OTA和DON暴露引起对虾肌肉组织损伤、营养成分降低、蛋白质组成及其生化特性显著变化,最终导致对虾肌肉外观品质和营养品质下降,其根本原因在于这些毒素诱导了特定功能性蛋白异常表达,引起对虾体内能量代谢紊乱、氧化还原反应异常及蛋白质合成障碍等不利影响。四种毒素对对虾肌肉品质的影响存在明显的毒性差异,其毒性作用大小依次为AFB1>T-2>OTA>DON。而槲皮素、芦丁和茶多酚在试验前中期(槲皮素:0.20-0.08%,芦丁:0.30-1.20%,茶多酚:0.04-0.16%)可以有效防控由真菌毒素暴露引起的对虾肌肉品质变化,且三种抗氧化剂的保护作用大小依次为槲皮素>芦丁>茶多酚,其原因源于它们能保护细胞结构的完整性,可通过抗氧化和调控蛋白表达起到解毒、抗炎和保护组织器官等作用。本研究结果为凡纳滨对虾养殖及加工过程中真菌毒素的危害监控及运用抗氧化剂防控其危害提供理论参数及技术指导。
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