一.研究背景:　　 支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞、气道上皮细胞等多种炎性细胞共同参与，以气流受限、气道重塑为特征的气道炎症性疾病，在世界范围内其发病率呈逐年增高的趋势，每年因哮喘而死亡的病人数高达10万人，造成巨大的社会负担。支气管哮喘哮喘的防治已成为当今世界共同关注的公共健康问题。　　 Th细胞在哮喘的发生和发展过程中起重要的调节作用。既往的研究发现，Th1/Th2失衡是哮喘的基本病理生理表现，Th2细胞释放炎症因子产生IL-4，IL-5，IL-9和IL-13等细胞因子，引发过敏性炎症及Th2-相关组织损伤，最终导致哮喘的发病。IL-4，具有代表性的Th2类细胞因子，能促进B细胞的增殖、分化，抑制其凋亡，诱导IgG或IgM向IgE的转化及多种炎性趋化因子的生成，加强局部嗜酸性粒细胞、Th2淋巴细胞、单核细胞及嗜碱粒细胞的募集，启动并维持气道炎症反应，引起哮喘的发作。同时，也可以通过刺激杯状细胞及纤维母细胞参与哮喘气道的粘液高分泌与气道重塑。Th1细胞分泌IFN-γ、IL-2、LT-α、TNF-β等细胞因子，促进吞噬细胞的活化及调理素、补体的产生，对细胞内病原体的清除发挥防御作用。IFN-γ作为Th1细胞代表性细胞因子，能促进天然T细胞向Th1的分化，抑制Th2细胞分化，调节嗜酸粒细胞的募集和活化，减少局部炎症细胞的浸润，从而维持Th1/Th2细胞的平衡，对哮喘的发病起保护作用。随着对哮喘研究的不断深入，这一理论并不能完全解释哮喘的发病机制。　　 近年来，区别于Th1、Th2的新型T淋巴细胞亚群Th17的发现，补充了这一理论。Th17特异产生的IL-17，可激活支气管上皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞，分泌IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、粘附分子（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）等炎症因子;诱导中性粒细胞在局部的募集和活化，上调Th2细胞调控的嗜酸粒细胞炎症，与气道炎症和气道高反应(airway hyperresponsiveness，AHR)密切相关。尤其，在非特异性、非IgE依赖、非嗜酸粒细胞炎症的哮喘中发挥重要作用。研究表明，IL-17促进气道上皮细胞粘蛋白5B(mucin5B，MUC5B)和粘蛋白5A(MUC5A)的表达，引起哮喘气道粘液的过度分泌。IL-17还可通过启动一系列炎性反应，造成肺组织破坏、气道平滑肌痉挛、气道上皮细胞损伤、上皮下纤维化等不良后果。因此，Th1/Th2细胞、IL-17/Th17可能共同参与了哮喘的发病机制，各T细胞亚群之间的平衡及其相互作用可能在哮喘的发生、发展中发挥了一定作用。　　 IL-17家族包括六个成员，分别为IL-17A，IL-17B，IL-17C，IL-17D，IL-17E，以及IL-17F.IL-17A有着极其广泛的生物学作用，可能通过诱导炎症调节因子产生参与包括支气管哮喘在内的多种免疫及炎症反应。IL-17F与IL-17A有很大程度的同源性，其生物学功能也很相似。IL-17F可诱导IL-6、IL-8、TGF-β及ICAM-1等细胞因子，间接促进中性粒细胞在气道的募集，影响气道炎症。既往研究发现哮喘病人经过敏原刺激后IL-17F基因表达上调，IL-17F能增强抗原诱导的过敏性炎症反应，可能与哮喘的易感性存在相关性。　　 遗传及环境因素在哮喘中发挥着重要作用，随着遗传学的不断发展，有关哮喘遗传易感性的研究引起了人们广泛的兴趣。目前据报道有超过100个哮喘相关基因被发现，如Toll样受体2(TLR2)、IL-4RA、STAT6、丝聚蛋白(FLG)、TNF、白三烯C4合酶(LTC4S)、PTEN基因等。　　 IL-17F基因长度为7742bp，包含3个外显子，位于6号染色体长臂。研究发现此区域与哮喘及其表型相关。IL-17F SNP rs763780位于3号外显子，该位点7488T/C碱基突变，使I7F第161位氨基酸由组氨酸(His)变为精氨酸(Arg)，蛋白质的改变导致IL-17F促进靶细胞分泌促炎因子的能力低下。作为一个功能位点，IL-17F His161Arg基因多态性已应用于多种疾病发生发展的关联研究。IL-17F His161Arg被认为与炎性肠道疾病(inflammatory bowel disease，IBD)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)、白塞氏病、胃癌、慢性疲劳综合征(chronicfatigue syndrome，CFS)等疾病有关。　　 近年来，IL-17F基因多态性rs763780与哮喘的关联性也引起了一些学者的关注。最新研究显示在日本人群中rs763780(H161R)基因多态性(TC/CC)与哮喘的发病相关，且体外功能实验揭示了IL-17F第3外显子上组氨酸突变为精氨酸，突变的IL-17F纯合子(CC)影响IL-17F与受体的结合力，还通过以下途径造成其功能的缺失:不能磷酸化ERK1/2，阻断了Raf-1—MAPK1/2—ERK1/2信号传导通路;不能诱导支气管上皮产生细胞因子及趋化因子，包括IL-8、IL-6及GM-CSF等的表达;不能像野生型有效地增强嗜酸粒细胞性过敏反应及气道重塑进程，因此降低了哮喘发生的风险。Ramsey CD等研究非裔和欧裔美国女性IL-17F基因分型，分析包括rs763780在内的50个SNPs未发现与哮喘相关。韩国学者Eun-Heui Jin等人分析了IL-17F基因多态性，结果显示启动序列rs1889570基因多态性与哮喘易感性有关，rs763780基因分型及等位基因在哮喘与健康人群中无差异。哮喘是一种复杂的多因素参与的疾病，上述结果存在一定的差异，原因可能为基因的异质性及环境等因素的不同。不同人群中SNP的分布频率不同，在Ramsey CD的研究中H161R在欧裔美国人的突变率为4.5％，远低于日本人(11.4％)。同时哮喘是一种复杂的，多基因遗传倾向的疾病，基因与基因之间有着相互作用及累积效应，从而使得遗传因素存在差异。哮喘的易感性还与环境因素有关，如吸烟（被动或主动）、空气中粉尘、宠物、职业暴露等等。这些均可造成实验结果的差异。目前国内外对于rs763780(H161R)基因突变与支气管哮喘的相关性研究报道较少。　　 二.研究目的:　　 本实验通过对哮喘患者血清中各T细胞亚群代表性细胞因子的检测，拟探讨IL-17/Th17、Th1/Th2在哮喘发病中的作用，分析哮喘的免疫学发病机制，同时初步研究IL-17F基因多态性与儿童支气管哮喘的关联性，为哮喘的免疫学治疗方法及其遗传易感性的筛选提供一定的理论和实验依据。　　 三.材料与方法:　　 1、研究对象及分组　　 (1)2011年3月-2012年10月于本院门诊随诊的60例哮喘患儿（临床缓解期），男38例，女22例，年龄2-15岁，平均5.3岁。均符合2008年中华医学会儿科学会呼吸学组制定的儿童支气管哮喘诊断标准，入组前一周均无使用激素及急性感染病史。　　 (2)对照组:2012年3月到2012年10月于本院健康体检儿童60例，男36例，女24例;年龄2-14岁，平均5.2岁。均无过敏性疾病病史，入组前一周均无使用激素及急性感染病史。　　 (3)两组儿童组间性别、年龄差异均无统计学意义，家长均知情同意参加该项研究。　　 2、标本采集　　 两组儿童均于清晨空腹留取外周静脉血3ml，其中1ml，于室温(20～25℃)放置60min，2000r/min离心10min，制备血清，-70℃冰箱冻存备检。另外2ml，提取全基因组DNA，-20℃冰箱冻存备检。　　 1.3采用ELISA方法测定血清IL-4、IL-17、IFN-γ细胞因子水平。　　 3、细胞因子IL-4、IL-17、IFN-γ的测定　　 3.1采用ELISA方法测定血清IL-4、IL-17、IFN-γ细胞因子水平。所有的检测步骤均严格按说明书进行，包括加样、封板、水浴、洗板、加酶、显色、读取OD值等操作。　　 4、IL-17F基因序列rs763780(H161R)基因多态性检测　　 4.1应用DNA测序法检测rs763780(H161R)基因多态性　　 (1)采用苯酚/氯仿提取法提取全基因组DNA。　　 (2)设计引物。　　 (3)PCR扩增目的基因。　　 (4)基因测序及分析　　 3、数据分析　　 计量资料采用x2检验，计数资料采用t检验。用SPSS13.0进行统计分析， P＜0.05作为差异有显著意义的检验标准。　　 四.结果:　　 1、血清细胞因子IL-4、IL-17和IFN-γ水平检测结果　　 哮喘儿童与正常对照组比较，IL-4水平高于正常对照组，差异有统计学意义(t=45.97 P＜0.05)。　　 哮喘儿童与正常对照组比较，IL-17水平高于正常对照组，差异有统计学意义(t=8.08 P＜0.01)。　　 哮喘儿童与正常对照组比较，IFN-γ水平低于正常对照组，差异有统计学意义(t=19.06 P＜0.001)。　　 2.IL-17F基因序列rs763780(H161R)基因型在两组内均未检测到突变型CC。rs763780(H161R)基因型(TC/TT)在两组间内的分布有明显的差异(x2=5.71, P=0.017＜0.05)。　　 3.TC基因型哮喘患儿与正常对照组比较，IL-4水平无统计学差异(t=22.69P＞0.05); IL-17水平无明显差异(t=3.79 P＞0.05);干扰素水平低于正常对照组，差异有统计学意义(t=12.92 P＜0.01)。　　 TT基因型的哮喘组与正常对照组比较，血清IL-4水平在两组间无统计学差异(t=38.43 P＞0.05); IFN-γ水平无统计学差异(t=14.26 P＞0.05); IL-17水平无统计学差异(t=3.77 P＞0.05)。　　 不同基因型(TT/TC)哮喘患儿组血清中IL-4水平无明显差异(t=0.38P＞0.05)。　　 不同基因型(TT/TC)哮喘患儿血清中IL-17水平无明显差异(t=1.58P＞0.05)。　　 不同基因型(TT/TC)哮喘患儿血清中IFN-γ水平有统计学明显差异(t=0.93P＜0.05)。　　 4.TC基因型OR和95％可信区间(CI)为2.09(1.12-3.90)，TT基因型OR和95％CI为0.76(0.60-0.95)。　　 五.结论:　　 本课题采用酶联免疫吸附实验、基因测序等方法，研究了IL-4、IL-17、IFN-γ在哮喘发病中的作用以及IL-17F基因多态性与哮喘的相关性研究。通过研究我们得到以下结论:　　 1、T细胞亚群的平衡与哮喘相关。哮喘患儿血清中IL-4、IL-17表达升高，IFN-γ分泌下降，提示我们哮喘患儿存在Th1细胞功能不足及Th2细胞功能亢进，IL-17/Th17可能在哮喘发病中发挥作用。　　 2、IL-17F基因多态性rs763780(H161R)基因型分布(TC/TT)在两组间存在差异，其多态性可能与哮喘相关;基因型CC在两组内均未发现;TC基因型哮喘患儿血清中IFN-γ水平低于TT基因型患儿及TC基因型健康儿童水平，提示基因型TC可能影响IFN-γ的表达;基因型TC与哮喘有关联，其OR值大于1，可能是哮喘的危险因素，可能与影响IFN-γ水平有关。