【摘 要】
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随着转基因技术的快速发展,转基因作物大面积种植,转基因产品的安全性备受社会关注。转基因生物检测标准物质是实施转基因生物安全管理和规范标识制度不可或缺的实物标准和必要保障。在国际贸易中贯彻安全管理法规,维护国家利益具有重要意义。然而,标准物质原材料的缺乏已成为标准物质发展的瓶颈。本研究通过克隆外源基因并与基因组DNA相结合,开发了一种新的标准物质研制策略。1.标准物质候选材料的制备。1)MON810
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随着转基因技术的快速发展,转基因作物大面积种植,转基因产品的安全性备受社会关注。转基因生物检测标准物质是实施转基因生物安全管理和规范标识制度不可或缺的实物标准和必要保障。在国际贸易中贯彻安全管理法规,维护国家利益具有重要意义。然而,标准物质原材料的缺乏已成为标准物质发展的瓶颈。本研究通过克隆外源基因并与基因组DNA相结合,开发了一种新的标准物质研制策略。1.标准物质候选材料的制备。1)MON810玉米外源插入序列的克隆。通过GM DD等网站初步确定,在MON810插入序列两侧的玉米基因组上设计引物,通过PCR、琼脂糖凝胶电泳实验对转基因玉米MON810插入全长片段进行克隆和筛选,将符合预期的7个扩增片段连接载体测序,确定序列正确的片段。用Ase I酶切目标片段,并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。然后对该片段进行纯化和回收。2)阴性基因组DNA的制备。比较了3种B73玉米基因组DNA提取方法。经质量检测,天根试剂盒方法提取的玉米DNA浓度和纯度都符合实验要求。2.微滴式数字PCR方法的建立。确定了最终反应条体系,并对退火温度进行优化,最终筛选出56℃为本实验研究的最佳退火温度。微滴数字PCR反应程序为:94℃预变性10 min、94℃变性30 s、56℃退火1 min、45个循环、98℃延伸10 min。3.内标准基因的比较。对玉米hmg、adh I-1、adh I-2、ivr I-1、ivr I-2、z SSIIb-1、z SSIIb-2、10k Da-1、10k Da-2九种内标准基因通过数字PCR实验进行比较研究,结果表明同一实验条件同一种样品条件下不同内标准基因的拷贝数不相同,并且ivr I-2没有出现阳性微滴、z SSIIb-1阴性阳性微滴没有分离开,10k Da-1下雨情况严重。最后发现adh I-1的拷贝数稳定且没有非特异扩增现象,雨滴数量少,作为本研究使用的内标准基因。4.标准物质定值。使用B73玉米阴性DNA对MON810 DNA进行梯度稀释,当稀释到7万倍时MON810拷贝数与adh I-1拷贝数比值接近100%。本实验研究的标准物质经6家实验室联合定值结果表明RSD在2%-3%之间,符合定值规定的RSD小于25%这一标准。对MON810混合型标准物质进行了均匀性、稳定性和不确定性检测分析。结果表明此标准物质的单元间与单元内均匀性良好,可以在常温下运输和储存14天。本研究研制了MON810混合型标准物质,解决了原材料缺乏的问题,并成功构建了微滴式数字PCR方法,为转基因及相关领域标准物质研制提供了技术参考。
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