研究背景瘢痕疙瘩(keloid)是皮肤发生创伤后形成的良性纤维增生性肿瘤,以真皮成纤维细胞增生及细胞外基质分泌增多为特点。瘢痕疙瘩切除后易于复发,尚无有效治疗手段。瘢痕疙瘩的发病原因未明,目前认为成纤维细胞在瘢痕疙瘩形成过程中发挥主要作用,研究成纤维细胞的增殖、凋亡、迁移等生物学特性及其细胞外基质和细胞因子分泌功能,对瘢痕疙瘩发病机制研究具有重要意义。基因的转录后调控,可在不造成细胞基因改变的条件下影响细胞的生物学特性,瘢痕疙瘩成纤维细胞的转录后调控目前鲜有研究。剪接因子SRSF2(serine and arginine rich splicing factor 2,SRSF2)也称SC35,可通过影响前体mRNA的剪接、出核及mRNA稳定等方式,调控下游基因的表达。有研究表明,该蛋白可影响多种细胞的凋亡、增殖等生物学特性,而在成体成纤维细胞中其作用尚无相关研究。因此,本研究拟探讨SRSF2对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学特性及功能的影响,为瘢痕疙瘩发病机制的研究提供新的思路。研究目的1.明确SRSF2在正常皮肤及瘢痕疙瘩组织中的表达差异。2.明确SRSF2对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学特性的影响。3.明确SRSF2对瘢痕疙瘩成纤维细胞ECM表达及细胞因子分泌的影响。研究法和结果1.SRSF2在癜痕疙瘩及正常组织中的表达鉴定方法:利用免疫组化检测SRSF2在正常皮肤与瘢痕疙瘩组织中的表达差异。结果:免疫组化结果显示,在瘢痕疙瘩组织中SRSF2阳性细胞多,且SRSF2表达于成纤维细胞细胞核。而在正常皮肤中,SRSF2阳性细胞表达量极少。二者有显著性差异(p<0.001)。2.生物信息学分析SRSF2在瘢痕疙瘩中可能的作用方法:通过在线数据库,获取SRSF2下游靶向基因,对其进行生物信息学分析;获取正常皮肤和瘢痕疙瘩组织基因表达谱,筛选差异基因进行生物信息学分析;取SRSF2下游靶向基因与正常皮肤和瘢痕疙瘩组织的差异基因的交集,进行生物信息学分析。结果:SRSF2下游靶向基因富集于转录调控、细胞外分泌、细胞信号转导、细胞周期等多方面;正常皮肤和瘢痕疙瘩组织差异基因主要富集于细胞外基质组成、胶原形成、骨发育、细胞粘附等方面;SRSF2靶向的差异基因主要富集于细胞外基质形成和降解、胶原形成和交联、生长因子结合等方面。3.SRSF2对正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学特性的影响方法:构建过表达及敲减SRSF2质粒,利用病毒载体,在正常皮肤成纤维细胞中过表达SRSF2,或在正常皮肤与瘢痕疙瘩成纤维细胞中敲减SRSF2,检测细胞生物学特性改变。利用Annexin V/7-AAD染色结合流式细胞分析检测细胞凋亡水平;并用PI染料结合流式细胞分析检测细胞周期;利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)绘制细胞增殖曲线;利用细胞划痕实验和transwell迁移实验检测细胞迁移能力。结果:SRSF2与成纤维细胞的凋亡水平、增殖能力及迁移能力有关。过表达SRSF2,可提高正常皮肤成纤维细胞增殖能力,并抑制其侧向迁移能力;敲减SRSF2,可提高正常皮肤及瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡水平,并抑制其细胞增殖。4.SRSF2对正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞功能的影响方法:在正常皮肤成纤维细胞中过表达SRSF2,或在正常皮肤与瘢痕疙瘩成纤维细胞中敲减SRSF2,检测ECM相关基因的表达及部分细胞因子的分泌。并利用TGF-βl刺激成纤维细胞,检测SRSF2表达。结果:正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞中敲减SRSF2,COL3A1、FN1表达降低,TGF-βl、CXCL12表达和分泌减少。而TGF-β1可促进成纤维细胞中SRSF2的表达。研究结论1.SRSF2在瘢痕疙瘩组织中的表达显著高于正常皮肤,且主要表达于瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞核。2.SRSF2参与正常皮肤及瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡、增殖及迁移的调控。过表达SRSF2,促进正常皮肤成纤维细胞增殖,并抑制其迁移。而敲减SRSF2,可促进成纤维细胞凋亡,抑制细胞增殖。3.TGF-β1可促进成纤维细胞中SRSF2的表达,而敲减SRSF2,细胞外基质相关基因COL3A1、FN表达降低,细胞因子TGF-β1、CXCL12表达和分泌减少。