胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease,GERD)是消化系统常见疾病,依据内镜下表现可分为反流性食管炎(Refluxesophagitis,RE)、非糜烂性胃食管反流病及Barrett食管三种类型。GERD在全球范围内发病率逐渐上升,治疗仍以质子泵抑制剂(Protonpump inhibitor,PPI)为主的抗酸治疗为首选,但临床上约有40%-50%的GERD患者对PPI治疗无效,或停药后复发,其中RE复发率高达90%,如何解决RE高复发难题是当前研究的重要任务。目前认为该病的发生主要与下食管括约肌基础压下降、一过性下食管括约肌松弛以及食管动力障碍相关,因此基于恢复下食管括约肌功能的抗反流治疗逐渐得到广泛重视和积极尝试,创立了经口咽胃底折叠术、磁性括约肌扩张、射频消融、食管下括约肌电刺激等一批新的治疗方式,但其有效性、安全性以及远期疗效等尚未形成统一意见。RE可归属于中医“胸痛”、“吐酸”、“胃脘痛”等范畴,辨证大多为本虚标实。我们的前期研究发现,RE复发患者脾虚证占37.6%,治疗主张采用健脾和胃、泻火降逆,方用六君子、左金丸、旋覆代赭石汤等加减,均取得较好疗效。虽然中医中药抗返流效果好,副作用少,但基础研究较薄弱。cajal间质细胞(InterstitialcellsofCajal,ICC)广泛分布于胃肠道,是胃肠慢波的起搏者,在胃肠动力调节方面有着不可或缺的巨大作用,其细胞正常的生理结构功能有赖于SCF/c-kit信号通道的正常表达。前期研究发现ICC也存在于食管下段,这可能成为GERD中医中药治疗潜在靶点,因此本实验旨在通过研究六君子合旋覆代赭汤对RE脾虚证大鼠食管ICC及SCF/c-kit信号通道的影响,揭示传统中药作用新靶点,为中医中药攻克本病高复发率难题开辟新路子。第一部分RE大鼠病症结合模型的探讨目的:对比研究不同浓度酸化胃蛋白酶持续灌注法、不同幽门结扎方式+前胃结扎法与大黄灌胃相结合建立RE脾虚证大鼠模型,筛选出理想的RE病症结合动物模型造模方法,为后续研究提供理论依据。方法:Wistar大鼠随机分六组(A-F),先进行RE造模:A组以0.25mol/LHCl + 0.5mg/ml胃蛋白酶混悬液持续灌胃(速度75μ1/min,持续30min,共计14天);B组以0.5mol/LHCl+0.5mg/ml胃蛋白酶混悬液持续灌胃;C组为对照组一,以等量生理盐水持续灌胃;D组采用幽门1/4缝合+前胃结扎法;E组采用传统幽门半结扎+前胃结扎法建立RE模型;F组为对照组二,仅开腹,15min后重新缝合;两周后RE造模完成。第15天开始进行脾虚证造模,A、B、D、E四组为模型组,以100%生大黄水煎液灌胃,2ml/只,每天2次,持续7天;C、F为对照组,以等量生理盐水灌胃。统计比较各组大鼠一般情况、死亡率、血清IL-6、IL-1β、IFN-γ含量以及食管下段组织病理表现,从有效性、安全性等方面对各造模方案进行评估。全结果:1)模型组大鼠活动度减少,少动、懒动、扎堆、弓背、不活跃;精神淡漠、易惊,对外界刺激的反应减弱;被毛为枯黄、蓬乱;饮食量逐渐减少,大便溏或干结;2)模型组大鼠血清IL-6、IL-1β、IFN-γ含量较对照组明显增高;3)病理表现:模型组大鼠食管下段黏膜可见不同程度乳头状增生、鳞状上皮增生、炎症细胞浸润等,可伴有黏膜溃烂;3)有效率与死亡率:A组大鼠有效率42.8%,死亡率30%;B组大鼠有效率60%,死亡率50%;C组为对照组,死亡率10%;D组大鼠有效率75%,死亡率20%;E组大鼠有效率100%,死亡率50%;F组大鼠死亡1只,死亡率14.3%。第二部分六君子合旋覆代赭汤对RE脾虚证大鼠食管ICC以及SCF/c-kit通道的影响目的:研究SCF/c-kit信号通道对ICC数目、形态结构以及功能的影响,探寻中药六君子合旋覆代赭汤治疗RE脾虚证的潜在作用靶点。方法:采用幽门半结扎+前胃结扎+大黄灌胃的方法建立RE脾虚证大鼠模型,实验动物随机分阴性对照组、阳性对照组、西药组、中药高、中、低剂量组共6组;其中西药组予以雷贝拉唑+莫沙比利混悬液灌胃;中药高、中、低剂量三组分别给予六君子合旋覆代赭汤高、中、低剂量灌胃;连续给药14天,1ml/只,1次/天;阴性对照组以及阳性对照组予以等量生理盐水灌胃。实验结束后取大鼠下段食管,进行:1)透射电镜观察食管下段组织ICC超微结构;2)Western blot法检测食管下段组织c-Kit及SCF蛋白含量;3)RT-PCR法检测大鼠食管下段组织c-Kit和SCF mRNA相对表达水平。结果:1)电镜观察:ICC存在于大鼠食管组织,本实验阴性对照组中ICC细胞结构完整,形态清晰,呈纺锤形,核体较大,胞质较少,胞质中含有大量线粒体以及丰富的内质网,有较多胞体突起,与周围细胞之间连接紧密;阳性对照组中ICC细胞数目明显减少,且细胞形态结构模糊,胞质内内质网扩张明显,线粒体空泡化现象严重,胞体未见明显突起,与周围细胞之间空隙较大,连接不紧密;中药低剂量组ICC细胞数目少,结构欠清晰,胞质内线粒体嵴溶解,内质网有扩张,胞体突触少,与周围细胞连接不紧密,中药高、中剂量组ICC细胞数目较阴性对照组有减少,细胞结构基本完整,胞质可见内质网以及线粒体损伤,胞体可见突起,与周围细胞之间缝隙连接较紧密;西药组镜下表现基本同阴性对照组。2)WB:相比于阴性对照组,阳性对照组c-kit、SCF蛋白表达水平明显降低(P<0.01);西药组c-kit、SCF蛋白表达水平较阳性对照组升高(P<0.01);中药高、中、低剂量组c-kit、SCF蛋白表达水平在性对照组与阳性对照组之间,差异具有统计意义(P<0.01);中药高剂量组c-kit、SCF蛋白表达水平稍高于中剂量组(P<0.05)。3)RT-PCR结果:相比于阴性对照组,阳性对照组c-kit、SCFmRNA相对表达水平明显降低(P<0.01);西药组c-kit、SCF mRNA相对表达水平较阳性对照组显著升高(P<0.01);较阴性对照组有升高(P<0.05);中药高、中、低剂量组c-kit、SCF mRNA相对表达水平均较阳性对照组升高(P<0.01);中药高、中剂量组c-kit、SCFmRNA相对表达水平差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论:1)酸化胃蛋白酶持续灌注法、幽门半结扎+前胃结扎法联合大黄灌胃法均可成功建立RE脾虚证大鼠模型,且幽门半结扎+前胃结扎法效果效果优于酸化胃蛋白酶持续灌注法;2)RE严重程度及动物死亡率与盐酸浓度及幽门结扎方式相关;3)幽门1/4缝合+前胃结扎法虽然RE严重程度不如传统幽门半结扎+前胃结扎法,但其方法简单,且对动物损伤小,术后动物易于存活,若适当延长造模时间,其RE严重程度可与幽门半结扎+前胃结扎无异,更适合于大量造模以及术后药物的干预治疗方面的研究;4)大黄灌胃可成功建立脾虚证大鼠模型;5)大鼠食管组织存在ICC,且RE脾虚证的发生与ICC结构、数目及功能的改变相关;6)c-kit、SCFmRNA及其蛋白表达减少导致SCF/c-kit通道障碍是引起ICC数目减少以及结构功能异常的最直接原因;7)中药六君子合旋覆代赭汤通过促进c-kit、SCF mRNA及其蛋白的表达以维持SCF/c-kit通道的正常功能,使得受损的ICC恢复正常,并进一步通过ENS-ICC-SMC信号网络调节LES功能,从而起到抗反流作用,并减少反流复发。