阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的老年痴呆症疾病,严重危害老年人健康和生命,目前对其致病机理还没有全面的了解。淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的突变以及γ-分泌酶错误地酶切C99(APP的C端99个氨基酸)导致阿尔兹海默病的发生已经广泛的被基因、细胞、动物实验证实。这使得类淀粉蛋白质致病假说越来越被科学界认可。γ-分泌酶在阿尔兹海默病致病中起着极其重要的作用,而其与底物的关系却一直没有得到科学全面的解释。目前临床针对阿尔兹海默病的药物都没有特别好的疗效。正确了解γ-分泌酶与C99底物的关系并获得C99和Aβ单独或者与γ-分泌酶的高分辨率结构将有助于科学阐述阿尔兹海默病的致病机理及正确的开发药物。为了揭示阿尔兹海默病病变机理,本实验着重于分析γ-分泌酶与阿尔兹海默病相关的C99突变底物的关系以及致力于解析C99和Aβ结构并从分子水平解释致病机制。我们建立了快速灵敏的Epsilon-酶切实验来研究γ-分泌酶对C99突变底物的酶切效率,并检测主要产物Aβ40和Aβ42产量及比列变化。我们发现这些突变能够一定程度地抵制γ-分泌酶的酶切,并且跨膜区C端在识别-结合-酶切过程中的重要性要远远高于其他区域。通过N端和C端截短实验,我们鉴定了C99片段(E22-K55)是在细胞内可以被γ-分泌酶识别并切割的最短底物。通过突变实验,我们发现最短底物N端的负电荷以及C端的正电荷簇在识别酶切过程中起着重要的作用。同时对跨膜区介导的C99二聚化的研究,我们发现一个不同于现在所报道的二聚化基序-TVIV,而这个基序是家族型阿尔兹海默病在C99上突变的热点位置。进一步分析发现,γ-分泌酶的酶切效率与跨膜区介导的二聚化具有一定的正相关性。结合酶学实验、最短底物以及跨膜区二聚化的研究,我们鉴定了γ-分泌酶识别-结合-切割底物的决定因素:(i)C99和Notch之间不同且可转移细胞外决定簇,而C99还需要胞外的负电荷,(ii)跨膜螺旋C末端一半的氨基酸序列,(iii)细胞内膜边界保守的的赖氨酸或精氨酸,(iv)包括不变赖氨酸/精氨酸的正电荷簇。因此我们提出了一个识别-结合-酶切模型。首先,C99的N端D1-A21片段以及C端Q56-N99片段对于γ-分泌酶的识别、酶切不是必需的。其次,其C端脂膜结合区域把底物锚定到γ-分泌酶附近,并促进其正确的构象。然后跨膜区C末端空间识别作用、N端的静电荷相互作用以及K53与γ-分泌酶活性中心的识别都为γ-分泌酶的酶切奠定了基础。同时采用晶体学研究,对C99和Aβ多肽进行表达尝试,运用定点突变、蛋白融合、蛋白质截短、二硫键引入、抗体共表达等蛋白质纯化、改造技术对C99和Aβ多肽进行表达优化,以及化学合成Aβ多肽并用于蛋白质晶体生长条件的筛选和优化。最终希望获得纯度高、构象均一的蛋白用于晶体生长,获得高质量晶体并解析其结构。结合结构生物学及生化细胞学方法探索阿尔兹海默病致病机制,为探讨神经退行性疾病的发病机制奠定基础。