【摘 要】
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目的:探讨晕清降压方含药血清是否可以通过激活TRPM8进而抑制细胞外Ca2+内流及Rho A/ROCK通路来松弛大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞,进而扩张血管降低血压,为揭示晕清降压方对肥胖型代谢性高血压大鼠的降压机制提供依据。方法:（1）运用组织块贴壁法+酶消化法对病证结合SD大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞行原代及传代培养。（2）利用免疫荧光染色法鉴定平滑肌细胞并观察TRPM8在平滑肌细胞上的表达情况。（3）
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目的:探讨晕清降压方含药血清是否可以通过激活TRPM8进而抑制细胞外Ca2+内流及Rho A/ROCK通路来松弛大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞,进而扩张血管降低血压,为揭示晕清降压方对肥胖型代谢性高血压大鼠的降压机制提供依据。方法:（1）运用组织块贴壁法+酶消化法对病证结合SD大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞行原代及传代培养。（2）利用免疫荧光染色法鉴定平滑肌细胞并观察TRPM8在平滑肌细胞上的表达情况。（3）通过CCK-8实验观察晕清降压方含药血清对细胞增殖的影响并挑选合适的干预浓度。（4）运用Western blot法观察薄荷醇（TRPM8激动剂）组、含药血清组、AMTB（TRPM8抑制剂）组、空白血清组的TRPM8蛋白表达情况。（5）采用Western blot法观察U46619（缩血管物质血栓素A2类似物）组、含药血清+U46619组、Y27632（Rho A/ROCK通路抑制剂）+U46619组、AMTB+含药血清+U46619组、空白血清组的Rho A/ROCK通路相关蛋白Rho A、ROCK2的表达情况。（6）通过多功能酶标仪检测毒胡萝卜素耗竭钙库后U46619+Cacl2组、含药血清+U46619+Cacl2组、AMTB+含药血清+U46619+Cacl2组细胞内Ca2+浓度变化。结果:（1）免疫荧光染色法发现标记的平滑肌特异性α-SMA抗体呈红色荧光,TRPM8抗体呈绿色荧光。（2）CCK-8实验可见,干预时间相同下,细胞活力与含药血清浓度呈现负相关关系,即随浓度升高,细胞活力逐渐下降;干预浓度相同下,作用时间越长细胞活力越低。以CCK-8实验确定的晕清降压方含药血清干预浓度为20%。（3）采用Western blot法发现AMTB组TRPM8蛋白表达较薄荷醇组、含药血清组、空白血清组明显减少（P＜0.01）,薄荷醇组和含药血清组TRPM8蛋白表达较空白血清组显著升高（P＜0.01）。（4）采用Western blot法发现,U46619组Rho A/ROCK通路相关蛋白Rho A、ROCK2表达较空白血清组显著增加（P＜0.01）,而含药血清+U46619组、Y27632+U46619组蛋白表达较U46619组显著降低（P＜0.01）,AMTB+含药血清+U46619组蛋白表达较含药血清+U46619组增加（P＜0.01）。（5）采用多功能酶标仪检测细胞内Ca2+浓度变化发现,事先予以毒胡萝卜素处理后三组胞内Ca2+浓度均升高,分别用药干预后U46619+Cacl2组胞内Ca2+浓度明显高于含药血清+U46619+Cacl2组,两组差异显著（P＜0.01）,而事先予AMTB处理的含药血清+U46619+Cacl2组见[Ca2+]i升高,且与含药血清+U46619+Cacl2组差异显著（P＜0.01）。结论:（1）平滑肌细胞内存在TRPM8表达,晕清降压方可以激活TRPM8。（2）在缩血管物质诱导下,晕清降压方可能通过激活TRPM8抑制Rho A/ROCK通路相关蛋白Rho A、ROCK2表达和胞外Ca2+内流,从而松弛平滑肌细胞、扩张血管,达到降低血压的目的。
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